一、肝脏生化检查
通过化学分析和生物化学的方法，可观察肝脏中某些成分及其含量的变化，从而弄清肝脏损害情况及可能机制。
（1）肝细胞内的化学成分变化
肝脂肪含量肝脏实质细胞中脂质含量变化反映某些肝脏损害的程度。对某些能引起脂肪肝而很少引起坏死的肝脏毒物（硫氨酸、磷等），测定肝组织中三酰甘油含量，常比血清酶检查更敏感，并常常呈量一效关系。
糖原某些化学致癌物，在染毒早期可使肝组织内糖原发生显著变化。
酶和辅酶的测定大多数情况下，肝脏中酶活力的变化对确定肝脏损害意义不大。但某些具有特异性的酶，如G-6-P（葡萄糖-6-磷酸酶），ACP（酸性磷酸酶）和OCT（鸟氨酸氨甲酰基转移酶）分别来自内质网、溶酶体和线粒体，其活性改变对于肝脏毒物的毒性评价及机制研究可提供实验依据。很多肝脏毒物还可引起肝脏GSH、ATP、 NADPH等含量减少。
脂质过氧化产物的测定脂质过氧化与某些肝损害有关。如CCl4染毒后，不饱和脂肪酸含量减少，饱和脂肪增多，共轭二烯、丙二醛增加，就是其证据。
（2）常用的反映肝功能的生化检查
①药物代谢试验因药物和其他外源性化学物质的代谢主要经肝微粒体酶催化，故肝脏对它们的代谢能力可用来作为肝损害程度的指标。常用巴比妥类药物引起睡眠时间的长短反映肝脏受损害的程度。具体做法是将一定剂量的巴比妥类药物物（苯巴比妥、硫贲妥钠、戊巴比妥均可）给予小鼠，观察小鼠睡眠时间（从翻正反射消失到恢复所经历的时间），因这类药由肝脏微粒体酶催化代谢，而睡眠时间长短与肝损害程度呈相关性，肝脏损害严重者，睡眠时间延长。
②染料排泄试验染料排泄试验可反映肝细胞在摄取、贮存、结合、排泄入胆汁各阶段的功能。常用的染料有磺溴酞（BSP）和靛青绿（ICG）。
③血清酶学检查是目前广泛使用的，较为敏感的检査肝损害的重要方法，被称作肝毒性的生物标记。其基本原理在于肝损害时，酶由细胞内大量释放入血。
各种血清酶在不同类型肝损害时敏感性并不一致，可以分为四类：第一类主要反映胆汁淤积性损害。此类酶有：碱性磷酸酶（AKP）、5＇-核苷酸酶（5′-NT）、亮氨酸氨肽酶（LAP）、Y-谷氨酰转肽酶（GCT）。第二类主要反映肝实质细胞损害。此类酶有：天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、苹果酸脱氢酶酶（MDH）、乳酸脱氢酶（LDH）、果糖-1，6-二磷酸醛缩酶酶（ALD）、丙氨酸氨基转移酶晦（ALT）、异柠檬酸脱氢酶（ICDH）、谷氨酸脱氢酶（CDH）、鸟氨酸氨甲酰基转移酶（OCT）、山梨酸脱氢酶SDH）、乳酸脱酶同工酶区带-5（LDH5）、果糖单磷酸醛缩酶（F-P-ALD）、精氨酸酶。第三类主要反映肝外组织损害。此类酶有：肌酸磷酸激酶（CPK）。第四类酶反应与前三种相反，肝损害时酶活性降低。此类酶有：胆碱酯酶（CHE）。

二、药物肾毒性的主要机制
（一）细胞毒作用
肾毒性药物可通过不同的机制，如产生自由基损伤线粒体功能，或影响溶酶体膜等，直接损伤肾小管细胞膜而造成肾损害。这种损害通常与药物剂量有关。
（二）免疫损害
具有半抗原性的药物与肾组织蛋白结合后作为全抗原，致敏肾组织而引起变态反应（Ⅱ型变态反应或Ⅲ型变态反应），从而导致肾小球或肾小管的损害，这种损害与药物剂量无关。
（三）降低肾血流量
非甾体抗炎药能抑制肾脏前列腺素合成，降低肾血流量，影响肾功能，严重时导致不可逆的肾毒性。如该类药物引起的肾乳头坏死，可能和乳头部位慢性缺血继发肾血管收缩有关
（四）机械性损害
难溶解的药物结晶，沉着在肾小管，引起肾损害。如磺胺结晶引起的血尿。

第二节 药物对心血管系统的毒性作用及机制
心血管系统是多种药物的毒性作用部位，药通过直接作用于血管平滑肌或交感神经，升高或降低外周阻力，导致血压的改变；通过损伤血管内皮和平滑肌细胞的功能，导致动脉粥样硬化、组织液生成增多及水肿、甚至出血；通过改变生物化学通路能量代谢、心肌细胞结构及功能、电生理学及心肌收缩性，产生心脏毒性，最终表现为心排血量减少和外周组织灌注量降低。药物心血管毒性作用的具体分子靶位包括:细胞膜表面受体与转运体、第二信使系统、离子通道、离子泵、酶等。在心血管部位神经递质的释放异常亦可影响心血管的功能而产生毒性作用。
一、血压异常
（一）高血压
一很多药物能引起血压的异常升高，使收缩压大于140mmHg及舒张压大于90mmHg，严重时造成血压骤升，尤其是当药物引起交感神经过度兴奋或单胺类递质释放增加时，如肾上腺素受体激动药、单胺氧化酶抑制剂，剂量过大或快速静脉注射可使血压骤升。血压过高使心室射血所遇的阻力过大，心肌后负荷过重，长此以往，患者可能出现左心室代偿性肥大、心脏扩大甚至心衰。此外，血压过高，血管壁也容易受损，如若累及脑血管，可发生脑出血。
人体的循环血量在神经和体液因素的调节下是相对恒定的，然而，多种药物可造成体液潴留、提高循环血量而影响血压。血液主要由血细胞、血浆蛋白、水和电解质等成分组成，其中水和电解质是左右血量的最活跃的因素，其吸收与排出的动态平衡维持着细胞内外液的相对稳定。激素类药物如泼尼松、地塞米松、甲睾酮或丙酸睾酮等，可引起水钠潴留，导致循环血量增加而发生高血压
除上述，某些降压药如中枢性降压药甲基多巴、胍乙啶，还有一些作用于外周受体的降压药如普萘洛尔，若长期应用后突停用，可引起高血压，即反跳现象。一些作用于神经节的降压药如美加明、米噻吩，若使用不当也可引起同样严重的后果。
（二）直立性低血压
低血压不同于高血压，没有明确的指征，药物引起的低血压大部分情况表现为一过性的直立性低血压或称体位性低血压，多数抗高血压药物当大剂量使用时，均可直接或间接地过度扩张血管而产生直立性低血压。血压过低使组织缺血、缺氧，甚至晕厥，有时还可导致反射性心跳加快，甚至心律失常。α受体阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）、硝基扩血管药物及具有外周α受体阻断作用的其他类别的药物，如抗精神病药、三环类抗抑郁药、IA类抗心律失常药等，均易导致直立性低血压。
二、血栓栓塞
血栓通常是因血管内壁受损，致血小板黏着在受血管所暴露出来的胶原上并聚集起来，且在血小板黏着胶原的同时，受损血管所暴露的胶原组织或其他组织，可激活血浆内的凝血因子，启动凝血过程，形成血栓。近年来，越来越多的文章报道，非甾体类抗炎药，尤其是高选择性COX-2抑制剂，具有心血管系统毒性，它们可减少PGI2的合成，而PGI2可以阻碍血小板的聚集，加之，治疗量的高选择性COX-2抑制剂对COX-1没有抑制作用，COX-1可以增加TAX2的合成，TAX2增加血小板的合成，它们因改变了TAX2/PGI2的比例而导致用药者出现血栓栓塞倾向
三、心律失常
当某些因素影响心肌细胞的自律性、兴奋性和传导性时，心脏搏动就会失去正常规律而发生快速型或缓慢型心律失常，K+、Na+和Ca2+等离子在心脏的起搏与冲动传导中起着重要作用，某些药物可直接影响心肌细胞的一种或多种离子通道，导致心肌田胞电生理特征发生变化，也可间接通过交感神和副交感神经影响心脏电生理活动以及干扰心脏的代谢
（一）快速型心律失常
窦性心动过速、房性心动过速、室性心动过速、室颤、尖端扭转型室性心动过速等均属快速型心律失常。其中，室颤和尖端扭转型室性心动过速是较危重的心律失常，当药物或毒物使心电图的Q-T间期显著延长超过460ms（正常约300ms）时，便容易产生致死性的尖端扭转型室性心动过速，常致心性猝死。如奎尼丁和索他洛尔在作为抗心律失常药物时，若用药不当反而可致心律失，尤其是有可能导致尖端扭转型室性心律失常及室颤等严重的病症。此外，洋地类药物中毒时也易造成心律失常，该类药物可因过度抑制Na+-K+-ATP酶，从而导致心肌细胞明显失钾，此为其对心肌细胞的直接毒性作用，还可通过影响交感神经和副交感神经发挥间接的心脏毒性作用，因其毒性作用机制涉及多个方面，加之心脏各不同特化部位对该类药物的反应各不相同，因此洋地黄类药物中毒可引起各种类型的心律失常，包括室性早搏、二联律、房性或室性心动过速、房颤或室颤等。
（二）缓慢型心律失常
窦性心动过缓、窦房传导阻滞、心房内传导阻滞、房室传导阻滞等均属此类心律失常，严重的窦性停搏和病态窦房结综合征是致死性缓慢型心律失常，药物等因素若引起迷走神经张力增大或窦房结障碍，在一段时间内窦房结停止发放激动，即可导致窦性停搏。Ⅳ类抗心律失常药物如维拉米，因拮抗血管平滑肌和心肌细胞上的钙通道，导致低血压，也可发生窦性心动过缓、房室传导阻滞。尤其是当该类药物与β-受体阻滞剂合用时，两类药物的负性肌力、负性频率及负性传导作用相加，可导致心肌收缩力减弱，甚至心室停搏。洋地黄类药物中毒时可直接抑制窦房结，使其自律性下降，还可使心脏传导系统的有效不应期延长、传导速度减慢，造成部分或完全性心脏传导阻滞。
有些药物或毒物急性中毒时可导致心脏骤停，表现为心室完全停止跳动或心肌呈不规则乱颤，二者可单独存在也可交替出现。这些药物，有些是因为对心肌的直接损害，有些是由于过强地刺激了迷走神经，还有些是由于中毒后引起的一些继发反应。
四、心肌病
药源性心肌病临床表现大多为类似扩张性心肌病，个别药物如儿茶酚胺类，引起类似于肥厚型心肌病。常见的引起心肌病的药物不多，主要是某些抗肿瘤药物和抗病原虫药物。药物引起心肌病的毒性机制较复杂，对心肌细胞的损害可以是直接的，也可以是间接的，还可因药物中毒引起的一些继发病症如休克，水、电解质代谢失衡等导致心肌细胞受损。依米丁是茜草科吐根属植物根中的主要生物碱，也称吐根碱，临床曾经主要用于治疗阿米巴病，但该药毒副作用较严重，尤其是对心肌的直接损害作用，大大地限制了其应用。大剂量依米丁可抑制心肌细胞的氧化磷酸化，导致细胞代谢异常，从而引起心肌病变，病理检查可心肌细胞浊肿变性。柔红霉素和多柔比星等含蒽环类结构的抗肿瘤抗生素也具心脏毒性，发生毒副作用时，早期可出现各种心律失常，药物蓄积量大时可致不可逆性心肌损害，甚至造成心力衰竭。该类药物可以螯合铁离子并消耗 NADPH，从而与细胞P450还原反应，形成半醌自由基中间体，进而产生超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基等，造成DNA、RNA及蛋白质等重要的生物大分子物质损伤，使心肌细胞变性、坏死
五、心力衰竭
直接造成心肌细胞死亡从而损害心脏，使心肌的舒缩功能下降以及心脏舒缩时所承受的负荷过大，是心力衰竭的基本病因。如阿霉素中毒可直接造成心肌细胞死亡，从而损害心肌的舒缩功能，临床常以心衰为要表现。另外还有一些因素属于心衰的诱因，是指在基本病因的基础上诱发心力衰竭的一些因素，其中，快速型心律失常是药物中毒引起心衰的常见诱因，因该因素一方面可使舒张期缩短，致冠脉血流不足甚至造成心肌缺血缺氧，另一方面可使心率加快，导致心肌耗氧量增加，最终造成心泵功能下降。如丙吡胺、普罗帕酮等抗心律失常药物，当过量中毒致心律失常时，可引起心力衰竭，尽管抗心律失常药物致心衰的发生率并不太高，但也时有报道，且常易发生于原来即有心律失常病症的患者身上。洋地黄类药物中毒时，不论是否出现心律失常均有可能诱发或加重心衰。负性肌力也是可导致心力衰竭的一类药物，如钙拮抗剂维拉帕米、地尔硫草等，过量或中毒时它们可直接降低心泵功能，静脉注射过快可发生心脏抑制，严重者可出现心衰。β受体阻断剂能有效地抑制β受体激活所介导的心脏生理反应，从而降低自律性、抑制心肌收缩力、减慢传导速度，但大剂量时可致缓慢型心律失常，并可诱发心力衰竭。

第三节 药物血液系统毒性评价与检测
血液一般检查通常针对血液中两种主要有形成分（红细胞和白细胞）进行量与质的化验检查，包括红细胞计数、血红蛋白含量测定、白细胞计数与分类、血小板计数等。近年来，多参数血液分析仪的应用不增加了检验结果的精确性，也为临床诊断提供了更多的指标。一次血液检查可以获得红细胞计数（RBC）、血红蛋白含量（Hb）、血细胞比容（Hct）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞体积分布宽度（RDW）、血小板计数（PLT）、血小板平均体积（MPV）、血小板比容（PCT）、血小板体积分布宽度（DW）、白细胞计数。通过骨髓细胞学涂片检查，可以了解骨髓中细胞质和量的变化。对于可能有氧化作用或能进行氧化还原的物质，还应当观察 MetHb和海因茨小体的形成。骨髓组织学分析包括骨髓细胞形态学、分类、细胞分化程度、基因结构和表达水平等。
常规的红细胞、白细胞、血小板计数方法本章不再赘述，其他几种方法如下。
一、网织红细胞计数
网织红细胞由晚幼红细胞脱核后但尚未完全成熟的红细胞，胞浆内尚有嗜碱性残余物质，细胞核已消失，外观与成熟红细胞区别。用煌焦油蓝等染色后，胞质中可见蓝或蓝绿色枝点状甚至网织状结构。
外周血中大量网织红细胞的异常出现（成人于红细胞的2％）被称为网织红细胞增多症，提示骨髓一种快速的补偿增生加强。一般在红细胞增高前，网织红细胞先增多，因此其计数可反映红细胞的增生情况。比如溶血性贫血时网织红细胞常增加，而再生障碍性贫血时常减少。缺铁性贫血铁剂治疗后，网织红细胞可增加至15％～20％。恶性贫血患者经叶酸、维生素B12等治疗后，在红细胞增加之前，网织红细胞已增加。因此，网织红细胞通常是骨髓红细胞生成功能的指征，不仅有助于血液病的诊断，还能跟踪观察疗效，调节药物剂量。
二、血细胞比容和红细胞指数
血液中红细胞占的体积百分比称作比容。血细胞比容是血液表观黏度的重要决定因素，血液表观黏度随血细胞比容呈指数增加。血细胞比容的测定方法有温氏法（Wintrobe）、微量毛细管法和微量电比容法。该指标有助于分析许多血液流变学参数，如全血黏度、血液和凝血过程的黏性、弹性、血沉等。
在测定血细胞比容的同一标本中，同时进行细胞计数和Hb含量测定，通过这三个数据可进一步计算出MCV、MCH、MCHC。
（1）平均红细胞体积（MCV）单位为飞升（fl），人正常值为85～93fl。
MCV＝每升血液中红细胞体积/每升血液中红细胞数
（2）平均红细胞血红蛋白量（MCH）单位为皮克（pg），人正常值为26～34pg。
MCH＝每升血液中血红蛋白含量/每升血液中红细胞个数
（3）平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）单位为g/L，人正常值为310～370g/L。
MCHC＝每升血液中血红蛋白含量/每升血液中红细胞体积
通过MCV、MCH、MCHC值的变化可分析红细胞的形态特征，有助于贫血的分类和鉴别。MCV和MCH值增大时，提示为大细胞性贫血，例如缺乏维生素B12、叶酸，营养性巨幼细胞性贫血，妊娠期巨幼细胞性贫血，恶性贫血等情况；MCV和MCH值减小时，提示为单纯小细胞性贫血，例如由感染、中毒等病因引起的贫血；慢性失血及缺铁时引起的小细胞低色素性贫血，则表现为MCV、MCH和MCHC值都减小。
三、中粒细胞功能检测
（1）中性粒细胞储备功能检测
①泼尼松刺激试验泼尼松具有刺激骨髓中粒细胞由储存池向外周血释放的功能，服用泼尼松后外周血中性粒细胞应有明显增高。泼尼松试验可反映骨髓中性粒细胞的储备功能，中性粒细胞减少者在服用泼尼松后周血中性粒细胞最高绝对值如大于20×109/L，表明中性粒细胞的生成和储备正常，中性粒细胞的减少可能由于骨髓释放障碍或其他因素所致。
②肾上腺素刺激试验白细胞（主要是中性粒细胞）进入血流后，约半数黏附于血管壁，成为边缘池的组成部分之一，此部分白细胞在外周白细胞计数中不能被反映出来。注射肾上腺素后血管收缩，黏附于血管壁上的粒细胞脱落，从边缘池进入循环池，致外周血粒细胞数增高。白细胞减少者如在射肾上腺素后外周血粒细胞上升值高于（1.5～2.0）×109/L，则表示血管壁白细胞黏附增多，称之为“假性”粒细胞减少。
（2）中性粒细胞功能检测
①粒细胞趋化、吞噬与杀菌功能试验成熟中性粒细胞具有趋化、吞噬和杀菌功能，发生缺陷时，即使其他细胞免疫与体液免疫功能正常，也可能发生严重的致命感染。趋化功能可用皮肤窗法、 Borden小室法或琼脂糖凝胶平板法检测；吞噬与杀菌功能可用白色念珠菌法、硝基四氮唑蓝（NBT还原法或化学发光测定法检测；溶细胞法更能直接反映细胞杀菌的情况，通过计数琼平板上生长的菌落数计算杀菌率。
②白细胞黏附试验白细胞在体外具有黏附于玻璃及异物的功能，并认为该功能与白细胞的杀菌和吞噬作用有关。将一定量的血液与一定表面积的玻璃接触一定时间后，即有一定量的白细胞黏附于玻璃表面，测定与玻璃接触前后白细胞数之差，可计算出白细胞黏附率。
四、血液细胞化学染色检测法
细胞化学染色检测是在血液细胞形态的基础上，根据化学反应的原理，应用涂片染色的方法研究细胞内化学成分的性质，包括种蛋白质、酶类、脂类、糖类、无机盐、核酸以及它们的代谢活动、生理功能和病理变化。因而这种方法能在形态学的基础上鉴别各种类型的血细胞，可作为血液毒性分析和鉴定的重要方法和手段。
过氧化物酶染色、苏丹黑B染色、糖原染色、酯酶染色、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶染色等有助于确定急性白血病的类型；铁染色有助于区别缺铁性贫血与非缺铁性贫血；碱性磷酸酶染色有助于鉴别慢性粒细胞白血病与类白血病反应，再生障碍性贫血与阵发性睡眠性血红蛋白尿症，真性红细胞增多症与继发性红细胞增多症等；酸性磷酸酶染色有助于急性淋巴细胞白血病的免疫学分型和鉴别 Gaucher病与 Niemann-Pick病；糖原染色有助于区分红白血病与严重缺铁性贫血、重型海洋性贫血及巨幼细胞贫血等其他红细胞系统疾病。
五、血液放射性核素检测法
放射性核素检测是利用放射性核素（radio nuclide）及其射线来进行疾病的诊断和治疗，其在血液学方面的应用大致可分为放射性核素功能检测，放射性核素形态显像和放射性核素体外分析三方面。
（1）放射性核素功能检测
放射性核素功能检测需要使用特殊的放射性药物，在血液学检查中更需要用放射性核素标记活体血液细胞作示踪剂，利用特殊的放射性探测器，通过探头在人体的指定部位或采集血液标本，探测放射性药物强度的变化或作连续的动态记录，绘成曲线，以了解血液细胞或相应脏器的功能。在血液学检测中，可进行红细胞容积、血浆容量、红细胞寿命、红细胞破坏部位和血小板寿命等多项检测
（2）放射性核素形态显像
各脏器的显像，必须使用特殊的放射性药物（radio pharmaceutical），利用药物的特性参与机体的代谢，使待测器官或组织富集或缺损放射性，达到示踪的目的。当该药物进入体内目的位后，即可在体外用专用的仪器（如扫描机、γ-照相机、发射型计算机断层）等获取核分布图像。在血液学中常用的显像有骨髓显像、脾脏显像、淋巴显像和血管栓塞部位显像等。
（3）放射性核素体外分析
放射性核素体外分析的基本原理是利用放射性标记抗原（＊Ag）和待测抗原（Ag）与有限量抗体（Ab）之间的竞争性结合而设计的。标记抗原的放射性核素有两类:一类是常用的125I和57Co标记，发射y射线，能直接测量另一类是3H和14C标记，发射β-射线，需用特殊的闪烁液做间接测量。在血液学方面应用于叶酸、维生素B12、铁蛋白（ferritin），、内皮素（ET）、血栓烷B2（TXB2）、6-酮-前列腺素F1a（6-ket0-PG-F1a）、环腺苷酸、环鸟苷酸和超氧化物歧化酶（SOD）等方面的检测。

第三节 其他单次给药毒性试验方法。
一、最大给药量法
在实际工作中，对于毒性低的化合物可用最大给药浓度和最大给药容量单次或24小时内数次给药，观察动物出现的反应。一般使用20只啮齿类动物，连续观察14，天如无死亡出现，则该剂量即为受试药的最大给药量。
二、固定剂量法
固定剂量法（fixed- dose procedure）不以死亡作为观察终点，而是以明显的毒性体征作为终点进行评价。选择5mg/kg、50m/kg、500mg/kg和2000mg/kg四个固定剂量进行试验，特殊情况下可增加5000mg/kg剂量组。实验动物首选大鼠，给药前禁食6～12小时，给受试物后再禁食3～4小时。采一次给药的方式。一般首先用雌性动物进行预试。根据受试物的有关资料，由上四个剂量中选择一个作为初始剂量，通常用500mg/kg作初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg/kg进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，即降低一个档次的剂量进行预试，如该动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续观察7天。在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量至少用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，由前面所述的四种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量进行试验。固定剂量试验法所获得的结果，参考表14-5标准进行评价。
表14-5 固定剂量法试验结果的评价
剂量（mg/kg）    存活数＜100％    100％存活，毒性表现明显    100％存活，无明显中毒表现
5    高毒（very toxic）（LD50≤25mg/kg）    有毒（toxic）（LD50 25～200mg/kg    用50 mg/kg试验
50    有毒或高毒，用5mg/kg进行试验    有害（harmful）（LD50 200～20000mg/kg）    用500mg/kg试验
500    有毒或有害，用50mg/kg试验    LD50＞2000 mg/kg    用2000mg/kg试验
2000    该化合物无严重急性中毒的危险性        
三、上下法（阶梯法，序贯法）
上下法（up and down method）最大的特点是节省实验动物，不但可以进行毒性表现的观察，还可以估算LD50及其可信限，适合于能引起动物快速死亡的药物，分为限度实验和主实验。
1．限度试验
主要用于有资料提示受试物可能没有毒性的情况。该法是最多用5只动物进行的一个序列试验。试验剂量一般为2000mg/kg，特殊情况下也可使用5000mg/kg。
2．主试验
在相关毒性资料很少或缺乏时，或预期试物有毒性时，应进行主试验。预先设定一个给药程序，在此程序中间隔至少48小时，每次给药1只动物。给药间隔主要取决于毒性出现时间、持续时间和毒性的严重程度。第一只动物的给药剂量低于LD50的最接近的估计值，如果该动物存活，第二只动物给予高一级剂量；如果第一只动物死亡或出现濒死状态，第二只动物给予低一级剂量。
四、非啮齿类动物的急性近似致死量及最大耐受量测定
近似致死量（approximate lethal dose，ALD）是介于最小致死量（minimum lethal dose，MLD）与最大非致死量（maximum non-lethal dose，MNLD）之间的剂量，均属于毒性的上限指标，而最大耐受量从广义的毒效应来看，应属于毒性的下限指标。在实际工作中，MLD、MNLD、ALD及MTD（最大耐受量）均可从啮齿类动物单次给药毒性量效（死亡）曲线上推算得到。我国药政管理部门认可的方法是以狗的单次给药毒性试验来获得这些数据，一般用6只健康的 Beagle犬，年龄为6～8月龄。具体方法如下。
（1）根据啮齿类动物单次给药毒性的各参数、或可参照受试药物的化学结构及其他相关资料，加以适当调整，估计对狗可能起单次给药毒性和死亡的剂量范围。
（2）按50％递增法设计出含10～20个剂量的序列表。
（3）根据单次给药毒性资料估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围。在此范围内，每间隔一个剂量给一只动物，给药途径应至少包括临床拟用途径，用等容量不等浓度给药法。
（4）从试验中得到最低致死剂量和最高非致死剂量，然后用两者之间的剂量给一只动物，此剂量即为近似致死剂量。未发现中毒表现的最高剂量即为最大耐受剂量。
五、累积剂量设计法（金字塔法）
非啮齿类动物进行单次给药毒性试验可采用累积剂量设计法（pyramiding dosage design）。经典的实验设计需要8只动物，分为对照组和给药组，每组4只动物，雌雄各2只。剂量的设计可以是1mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、30mg/kg、100mg/kg、300mg/kg、1000mg/kg、3000mg/kg，也可以采用10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg、320mg/kg、640mg/kg、1280m/kg，通常隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐加大，直到出现动物死亡时或达到剂量上限时止。
当没有动物死亡时，MLD和LD50大于最高剂或限制剂量。当在某一剂量所有动物均出现死亡时，MLD和LD50应在最后两个剂量之间。当在某一剂量部分动物出现死亡，部分死亡出现在后继的下一个高剂量，此时，MLD位于首次出现死亡的剂量和前低剂量之间，LD50则应在首次出现动物死亡的量和所有动物均死亡的剂量之间。假如没有动物死亡发生，常常以最高剂量给予动物5～7天，以确定后续的重复给药实验中高剂量的选择。

三、多次用药剂量水平的选择
选择合适的剂量水平可能是重复给药毒性试验设计中最为困难的任务。鉴于重复给药毒性试验的基本目标，三个剂量组是必不可少的：其中一个是足以引起明显的或严重的毒性反应的高剂量组，但又不能造成太多动物中毒死亡，死亡率应控制在10％以内，第二个是不引起毒性作用的低剂量组，为表明毒性作用的量-效关系，在上述两个剂量之间插入一个（或多个）中间剂量组。在实际操作中，要恰到好处的选择到既出现毒性症状，又使死亡率不超过10％的高剂量是非常困难的。更为现实要求应是在不造成过多动物死亡的前提下，在高剂量组动物中得到确切的毒性作用资料，低剂量原则上应高于同种动物药效学试验有效剂量或预期临床治疗剂量的等效剂量，并不使动物出现毒性反应。据以往经验，低剂量如在预期临床治疗剂量的等效剂量3倍以上不出现毒性反应的话，则此临床用量基本上为安全剂量。
重复给药毒性试验的最高剂量要求仅出现轻度毒性，而不改变实验动物的正常寿命，或至少在给药的前四分之一时间内不影响动物的体质，外观无异常，不过可以表现为血清酶活力的改变或轻度体重增长抑制（不超过10％）；低剂量应是完全无毒的。如在90天重复给药毒性试验的基础上进行重复给药毒性试验，亦可用90天试验中体重增长不到10％的剂量作为MTD（最大耐受剂量）。以此MTD为慢性试验的最大剂量，另外两个剂量通常是1/4MTD和1/8MTD。重复给药毒性与重复给药毒性实验二者的剂量关系如表15-4所示。
表15-4重复给药毒性试验剂量设计
　　剂量组    剂量
　　高剂量    重复给药毒性试验的高剂量与中剂量之中值
　　中剂量    重复给药毒性试验高剂量与低剂量之中值
　　低剂量    不低于高剂量的10％
在选择合适的剂量时还应考虑到：①供试药物在体内的生物蓄积作用。测定药物在不同的组织、器官和体液中的半衰期，可为估计药物在体内的蓄积程度提供有价值信息；测定有关的蓄积参数，也可了解药物的蓄积性。对于高蓄积性药物应适当减少其剂量，否则在重复给药试验结束时各剂量均有可能出现毒性作用。②供试药物是否有可能被特殊的酶所“解毒”或“活化增毒”，而这些酶又是否易被供试药物本身所诱导或抑制。例如，某药物如果抑制与其本身代谢解毒有关的酶，则该药物的给药剂量应酌情减少。③供试物在消化道中的稳定性与胃肠道内容物有亲和性的供试药物，则应酌情增加剂量，实际上在这种情况下应考虑的是作为口服给药是否合理的问题。下面介绍几种具体方法供参考。
（1）半数致死量法（LD50法）
根据单次给药毒性的LD50值决定三个剂量。一般在大鼠3个月重复给药毒性试验中，高、中、低三个剂量可分别采用约LD50的1/10、1/50和1/100剂量，狗各剂量组可采用大鼠应各组的1/2～1/3剂量。此法为粗略估计，差异较大，一般只做预测的参考。当急性毒性试验和重复给药毒性试验用的是同一种动物时，参考价值相对大一些；反之，如LD50是小鼠的结果，则对长毒的大鼠和狗来说，因种属差异而造成的误差和风险将更大些。为了克服这一弊端，可先进行过渡性短期试验，以了解受试物的蓄积性特征。
（2）短期蓄积试验过渡法
重复给药毒性试验存在着多次给药的蓄积性作用，故单纯地以几分之几的LD50作为剂量设计依据，则十分不可靠。所以如何将单次给药试验的结果加以合理过渡，使之符合重复给药试验规律是在剂量设计时首先应重点考虑的问题。在获得单次给药毒性的有关资料后，应根据其所提供的有关信息，如毒性的量效关系，毒性征出现的剂量范围及敏感物等，先过渡到7～21天短期的蓄积性试验（图15-1），初步将单次给药毒性的参数外推于重复给药试验。这种过渡性短期试验，从表面上看是增加了工作量，但实际上会大大提高工作效率。另外对于某些只需单次给药的药物，这类试验一般已能满足药监部门的要求。但这种外推往往也仅能得到一个大致的剂量范围，对于产生具体效应所需剂量的估计（如最大无作用剂量或最小有作用剂量）往往把握不大，可靠程度有限。更为合理和可靠的办法还是先用少量动物进行短期的剂量摸索试验（或称预试验，range finding test）。

图15-1重复给药毒性试验程序安排
① Traina法
先从大鼠的单次给药毒性试验中找出最大无症状剂量，再分别以该剂量及其1/3和1/10量给三组大鼠（雌、雄各半）连续给药2～3周，从中找出亚急性试验的最高剂量，在此剂量下动物仅出现轻微的毒性反应，如食耗量略减，体重增长率略慢等。再以大鼠亚急性毒性试验的最高剂量为起点，给狗单次给药，根据观察结果适当增减剂量（对数间隔），找出狗单次给药的最大无症状剂量，再分别以此剂量及其1/3和1/10量给少数狗连续给药2～3周，找出狗亚急性毒性试验的最高剂量。
② Homburger法
选择一个剂量给雌、雄各5只大鼠，连续给药2周，如果无动物死亡再成倍增加剂量，直至首次出现死亡。相反如果第一个剂量就出现死亡，则成倍减少剂量，直至首次无死亡出现。上述范围摸索也可在设计好一个系列剂量后一次完成。依此试验结果计算出最大耐受量MTD（在此指不引起动物死亡但又出现严重中毒症状的最大剂量）。例如，某药在一个剂量序列中，500mg/kg时未出现动物死亡1000mg/kg时动物死亡1只，则此两值分别为最大非致死量和最小致死剂量，其对数的均数为2.8495，取其反对数得MTD为70mg/kg，此法求出的MTD可作为亚急性毒性试验的最高剂量。
MTD＝lg-1［（lg最小致死剂量＋1g最大非致死剂量）/2］
＝lg-1［（lg1000＋lg500）/2］＝707mg/kg
③Weil法
取初断乳大鼠若干只，随机分为3～4组，每组雌雄各5只。连续给药7天，以死亡率、体重、肝肾指数和进食量的改变为观察指标。Weil等曾对20种化合物的7天最小有效量（MIE7天）与90天的最小有效量（MIE90天）进行了分析比较，经统计学处理后发现，包括95％试验数值的比值为：MIE7天/MIE90天＝6.2，即MIE90天＝MIE7天/6.2。
通过7天的剂量摸索试验，基本上可以由此比例关系外推90天试验的各有效剂量。此外，Weil等人的研究结果也表明以7天试验的有效剂量外推90天试验的剂量比直接用LD50来推算更有规律，更为可靠。
这类剂量摸索试验方法学上灵活性很大，而且鉴于药物内在毒性的变异性很大，故不应拘泥于其一固定形式。事实上各个实验室往往根据各自的实践经验形成了一套各具特色的方法，而且实践也证明是行之有效的。
（3）最大耐受量法（MTD法）
用大鼠单次给药毒性的最大无症状剂量，即一个最大耐受量（1MTD）、1/3MTD、1/10MTD分别作为大鼠重复给药毒性试验的高、中、低三个剂量，同样狗和猴可采用大鼠1/2～1/3左右的剂量，也可参考狗或猴单次给药的MTD。此法对大部分受试物有参考价值，但少数蓄积性大的则不合适。
（4）临床拟用剂量法（ACD法）
根据同类型物或国外资料或临床拟用剂量推算，一般3个月重复给药毒性试验时，大鼠高、中、低剂量组可分别采用50～100倍、25～50倍和10～20倍临床剂量，狗可分别采用30～5倍、15～25倍和5～10倍临床剂量，猴可采用与狗相近剂量或略低于狗的剂量进行验。此法参考价值较大，也较常用。以临床拟用剂量为基数设计重复给药和重复给药毒性试验的剂量可参见表15-5。
表15-5 重复给药和长期试验相当于临床拟用剂量的倍数
试验类型    高    中    低
重复给药    啮齿类动物    100    30    10
   非啮齿类动物    50    15    5
长期    啮齿类动物    50    15    5
   非啮齿类动物    30    9    3
（5）等效剂量法
根据人和动物的等效剂量比值，再按一定倍数扩大。此法参考价值较大，尤其是对抗肿瘤药、镇痛药和外用药等更有意义。
上述方法是前人在一定条件下对某些药物毒性研中摸索和总结出来的经验，有一定的参考价值，受到毒理学界的重视。但同时必须认识到，药物千差万别，各种各样，任何机械照抄照搬都是不可取的，而应当是个案研究，对具体药物进行认真而细心地分析和预试，这才是摸准剂量的关键。