第一节　免疫学研究中实验动物的选择与应用

一、免疫学研究中实验动物的作用

免疫学是近年来医学科学中发展较快的一门学科。随着分子生物学、免疫化学等的发展和免疫学新技术的应用，免疫学得到了飞跃发展，不仅改变了许多旧的传统观察，而且由于免疫学的知识已渗透到医学科学的各个领域，形成了多种新兴学科，给许多疾病的诊断、预防及治疗开辟了广阔的前景。现在在医学理论与医学实践中，涉及有关免疫学的问题越来越多，受到人们广泛的重视。

免疫学的发展与实验动物科学兴起有密切关系。免疫学的研究，包括从预防感染到区别机体自身或非自身的基本生物现象有研究，一般多选用实验动物作对象，而且免疫学上的大量知识是通过动物实验获得的。特别是各种近交系和突变系动物、无菌动物、悉生动物及无特定病原体动物的培育，为免疫学研究提供了重要手段，大大促进了免疫学的发展。

为了研究免疫反应的原理以及发病机理的本质，单从人体内进行研究是非常困难的，我们观察病人，无法了解他的遗传背景，他过去和现在所处的环境，检查前的免疫状况以及今后发展的过程。以老年的免疫反应来讲，虽然许多人对老年时的免疫状态作了许多工作，但由于个体差异非常之大，单纯用平均数很难说明问题，因为只能代表一个趋势，而不是每个个体的真正反应。在这一群人中间，过去的基础不相同，因而不能同过去比较，就是用平均数字也不能肯定当时的水平，无法确定，是结果还是老年的原因。各种免疫病也是如此。因此，要真正了解免疫的本质，就不能单在病人身上或取血做体外实验，应主要在动物模型上进行研究，才能克服上述困难，取得更多真正能解决根本问题的突变性研究成果。

二、影响实验动物免疫反应的因素

免疫反应是随着动物种的进化而复杂化、精密化和完善化的，不同品种和品系动物的免疫反应有很大差异，因此在免疫学研究中选择动物时要特别注意动物遗传因素的影响，还要注意动物的年龄因素、感染因素、营养因素、药物因素、母源因素、应激因素、免疫抑制剂等因素对动物免疫反应的影响。

（一）动物的遗传因素

根据研究表明小鼠、豚鼠、家兔等动物对特异性抗原的免疫反应受遗传控制。动物体内免疫反应的基因决定着动物对各种疾病的易感性，决定着自身免疫病和体液免疫反应。这种免疫反应的基因紧密连接在这些动物体内主要组织兼容系统上。如带等位基因H-2b的小鼠（如C57BL，C57L，129/J）比带有等位基因H-2K的小鼠（如C58，AKR，C3H）的抵抗力强，后者对小鼠白血病病毒和肿瘤病毒十分易感，又如SWR/J（H-2q）小鼠对淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCM）非常敏感，而C3H/J（H-2k）小鼠对该病毒有强大的抵抗力。这些例子说明由于遗传因素的影响，不同品系动物的免疫反应是有明显差异的。此外，不同种类动物的免疫反映也有差异，如研究第Ⅳ型变态反应（Arthus反应），家兔是一种好的实验动物，而豚鼠和大鼠不能采用。豚鼠通常产生少量的IgM。

脊椎动物免疫系统的发生与种系化密切有关（见图10-1、2和表10-1）：原始脊椎动物的淋巴器官发育还不完善，如圆口类动物沿其消化道有散在的淋巴结和淋巴细胞，并出现了胸腺，随着进化有了原始的肾脏，在鱼类还出现了肝脏。这些器官和组织开始时也多分布在消化道附近，这是由于原始脊椎动物（圆口类）及鱼类摄食时吸进大量水，并通过鳃孔将水排出，因此咽头部最先遭受病原微生物的侵击，为此在消化道附近产生了相应的御体系。而到了高等脊椎动物，由于种系的进化，这些器官的分布就多样化了。但从高等动物胸腺个体发生来看，它也是从第三、第四咽囊腹侧上皮演化发育而来，说明这跟种系发生有关。

虽然圆口类动物就能产生IgM，但无控制B淋巴细胞分化发育的中枢器官，至两栖类开始出现较原始的类囊器官。而爬行类动物的类囊，位于消化道的末端。鸟类以外其他动物有类体液免疫完善的免疫系统。

因此，在免疫学研究中进行实验动物选择时，要特别注意遗传因素对免疫反应的影响，各种实验动物具有不同的免疫反应和免疫特点。下面再举个典型例子。实验动物补体系统各成分的缺陷因实验动物的种类不同而有明显差异。

补体缺陷（Complemenr　Deficiencies）

图10-1　脊椎动物的免疫反应

图10-2　免疫应答反应的种系发育主要代表

C1　鸡

C2　豚鼠、大鼠

C3　狗（Brittary　Spaniel）

C4　金黄地鼠

C5　小鼠（K/HeN.AKR/N、B10、DZ/DsnN）

C6　兔、地鼠

当C1g缺乏时可出现严重的联合性免疫缺乏病，反复发生威胁生命的感染；C1r缺乏时发生坏疽性红斑，反复的细菌感染，狼疮样综合症；C1s缺乏时，出现红斑狼疮，进行性肾小球肾炎，关节炎；C4缺乏时可发生狼疮，关节炎、类过敏性紫癜；C2缺乏时发生狼疮，致死性皮肌炎，类过敏性紫癜，狼疮样综症，进行性肾小球肾炎，反复感染；C3缺乏时对感染的易感性升高；C5缺乏时可发生狼疮，腹泻及消耗病：C6缺乏时，可发生反复G（-）感染，淋菌性多关节炎，反复发生脑膜炎。

表10-1　脊椎动物免疫系统种系发生的比较

动　物

细　胞

淋　巴　器　官

免　疫　反　应

分类

动物 名称

淋巴细胞

浆细胞

胸腺

脾脏

淋巴结

法氏囊

细胞免疫

体　液　免　疫

IgM

IgG

IgA

IgE

IgD

圆口类

鳗

+

-

+

-

-

-

+

+

-

-

-

-

鱼类

油鲛

+

-

+

+

-

-

+

+

-

-

-

-

鲤鱼

+

+

+

+

-

-

+

+

-

-

-

-

两栖类

蝾螈

+

+

+

+

-

+

+

-

-

-

-

青蛙

+

+

+

+

(+)

+*

+

+

+

-

-

爬行类

龟蛇

+

+

+

+

(+)

？

+

+

+

-

-

-

鸟类

鸡

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+？

-

-

哺乳类

鼠、人

+

+

+

+

+

+*

+

+

+

+

+

+

（+）可能存在，+*有功能相似的类囊器官。

图10-3　各种动物胸导管淋巴细胞数目的变化（细胞数/公斤体重）

（二）动物的年龄因素

免疫学研究中选择适宜年龄的实验动物是非常重要的，年龄影响着实验动物的免疫机能。如幼龄动物的免疫系统机能发育不完善或机能很弱。一般来说，动物的免疫机能在青年期达到高峰，以后随着年龄增大逐渐减弱，主要表现有血清中免疫球蛋白含量低，细胞免疫功能下降，恶性肿瘤和自身免疫性疾病的发病率增高等。据研究，小鼠、大鼠和豚鼠随年龄增加免疫反应的活性也减弱，老龄鼠产生IgG和IgM的能力仅为年青成年鼠的10%左右，细胞免疫同样也减弱。因此，老龄鼠对诱发肿瘤极敏感。

实验证明给胚胎期或新生期的动物注射异基因型细胞时很容易造成对该细胞的免疫无反应性（Immunolgical　Unresponsivenss），而对成年动物注射异基因型细胞时通常可引起免疫反应。据认为这种免疫耐受性与免疫系统（包括中枢淋巴样器官即骨髓、胸腺和外周淋巴样器官即脾脏、淋巴结、肠管相关淋巴样组织以及循环的淋巴样细胞）的发育未臻成熟有关。

Heidrick和Makindan氏认为老龄鼠细胞免疫中免疫细胞的缺乏，可能是由于T细胞和B细胞没有能力增殖的缘故。通常以为动物越是趋于老年，免疫反应的自隐机制被破坏的机会就越多，因而发自身免疫疫病的机会就越多。这种自稳对动物的正常生命活动乃至生存具有重要意义。在正常情况下，健康机体对自己的细胞、非细胞成分如蛋白质、多糖等是不发生“明显的”免疫反应的（自身免疫耐受状态，Selftolerance），而对非自己的抗原则发生免疫反应，也就是说机体通过免疫系统能识别“自己”和“非自己”。这种自我识别能力称之为自稳机制。

（三）动物的母源因素

各种哺乳类动物的胎儿和出生仔畜免疫的获得不同。在初乳中主要为IgA，初生动物血清中的母源抗体大部分为IgG，对仔畜预防病毒和细菌感染起着一定的保护性免疫作用。大部分IgA对粘膜表面起着局部保护作用，而IgG起着总的保护作用。但是母源抗体还有有害作用，它能诱发新生动物溶血病（如驹）和抑制出生动物的主动免疫。

雌性动物将母源抗体转移给胎儿或仔畜的途径和特异性不同，这与动物胎盘的结构和类型有关（见下页表10-2），一般来说，有三种主要的转移途径，随动物种类不同，有的经绒毛膜尿囊胎盘转移；有的经卵黄囊上皮和卵黄循环转移；还有是初乳经肠道吸收。前两者被认为是胎儿期获得抗体的途径，后者为出生后转移抗体的途径。

免疫球蛋白的转送是有选择性的，有些种类的抗体易转移，同种（系）抗体转移比异种抗体快。胎盘对各种母源抗体也有选择性，如：灵长目中Igg　易通过胎盘屏障，IgM、IgA和IgE则不能。家兔的IgG和IgM易通过胎盘到达胎儿。关于母源抗体选择性的转移机制还不清楚，一般认为，这种选择性的转移是由于组织能选择性地识别抗体的F。端造成的，母源抗体转移中具有选择作用的组织见表10-3。动物常乳和初乳中检出抗体的类型见表10-4。

表10-2　动物的胎盘屏障和母源抗体的转移

动　物	胎盘类型	结构（层数）	转移途径	选择性	抗体转移		持续时间
					出生前	出生后
小鼠	血性绒毛膜	4	肠（主要）卵黄囊	+	+（卵黄囊）	艹	出生到17天
大鼠	血性绒毛膜	4	肠（主要）、卵黄囊	+	+（卵黄囊）	廿	出生到20天
豚鼠	血性绒毛膜	2	卵黄囊（主要）、肠	？	卅	+	整个妊娠期间和出生后2天内
家兔	血性绒毛膜	2	卵黄囊	+	卅	-	从妊娠开始15天起
灵长类	血性绒毛膜	2	胎盘	+	卅	卅	妊娠开始3个月
猬			肠	+	-	艹	出生到35天
狗	内皮绒毛膜	4	肠	？	-	卅	出生到8天
猫			肠	？	-	卅	不定
水貂			肠	？	-	卅	出生到8天
雪貂			肠	？	-	卅	出生到34天
猪	上皮绒毛膜	6	肠	-	-	卅	出生后36小时
马	上皮绒毛膜	6	肠	-	-	卅	出生后36小时
牛	结缔组织绒毛膜或上皮绒毛膜	6	肠	-	-	卅	出生后36小时
绵羊	结缔组织绒毛膜或上皮绒毛膜	6	肠	-	-	卅	出生后36小时

表10-3　母源抗体转移中呈现选择作用的组织

动　物　种　类	组　织
灵　长　目	胎　盘
大鼠与小鼠	肠
家　兔	卵　黄　囊
偶　蹄　兽	乳　腺
鸟	卵黄囊膜

表10-4　动物常乳和初期中免疫球蛋白类型

动　物	常乳和初乳中免疫球蛋白类型
家　兔	初乳	IgA
灵长目	初乳	IgA
大　鼠	初乳 常乳	IgA(多量)IgGa,IgGb,r1,IgM(很少)
		IgG（多量）
小　鼠	初乳	IgA,快和慢的IgG
狗	初乳 常乳	IgG(多量)，IgA，IgM
		IgA(多量)，IgG，IgM
猪	初乳 常乳	IgG(多量)，IgA，IgM
		IgA(多量)
牛	初乳	快IgG(r1)IgM(β2)
绵　羊	初乳	快IgG(r1)，IgA

（四）动物的感染因素

病毒、细菌、真菌或寄生虫的感染都能多方面地改变动物机体的生理功能，这种改变无疑将影响到动物的免疫系统。动物感染可引起继发性营养不良，从而影响到免疫反应。一般实验动物常发生病毒的隐性感染，在以下几方面影响免疫功能：抗体产生的方式，免疫球蛋白的数量，免疫耐受性的产生，植皮排斥，植皮对宿主的反映，迟发型变态反应，淋巴细胞转化和吞噬作用等。

动物病毒感染引起的免疫抑制表现：干扰正常免疫系统的功能；改变抗原的吸收和处理；破坏抗体形成细胞和浆细胞（如白血病病毒）。病毒感染后也可引起免疫增强的表现，如乳酸脱氨酶病毒LDH，委内瑞拉马脑脊髓炎病毒VEE等病毒，能增加产生抗体细胞数量：感染病毒的细胞能产生微量核苷酸，起着佐剂的作用；病毒还能促进免疫细胞对抗原的处理。

动物感染呼吸道病毒、腺病毒、流行性脊髓灰质炎病毒、仙台病毒、痘苗病毒、单纯疮疹病毒、新城疫病毒等病毒时，能够抑制淋巴细胞的转化。肝炎、肢骨发育不全（Ectromelia）、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎（LCM）、乳酸脱氨酶病毒（LDH）能抑制网内皮系统的机能。而Friend白血病、Moloney白血病和委内瑞拉马脑脊髓炎（VEE）能增强吞噬细胞的吞噬作用。

三、实验动物免疫反应的特点

（一）灵长类（除人外）

灵长类动物主要有四种免疫球蛋白，即IgG、IgM、IgA、和IgE。新界猴（除一种卷尾猴外）没有发现IgA。已证明在猕猴、狒狒和黑猩猩中有抗寄生虫性抗原的IgE抗体，但在新界猴中仍无此种抗体。高等灵长类与人的免疫球蛋白有较强的交叉反应，但长臂猴例外。

灵长类动物具有血性绒毛膜胎盘，只允许IgG通过，IgM、IgA、IgD和IgE是不能通过的。新生的猴子不能从初乳中吸收抗体。妊娠第九个月猕猴的胎儿和成年猕猴在抗原初次刺激后6天产生IgM，妊娠第58天的胎儿对同种植皮产生排斥，而羊胎儿的这种反应发生在80天。

80%出生的狨猴是胎盘血管吻合的双胎。用性别染色体分析能证明不同性别的双胎中血液存在交换。在血液交换的狨猴双胎中，异性共生的双胎已证明有免疫耐受现象。因此，它们之间互相接受植皮。狨猴对接受不同亚种的植皮有免疫反应，亚种内植皮要比亚种间植皮存活的时间约长一倍。

灵长类动物在研究人的反应素（IgE）型超敏反应中起着重要作用。反应素型抗体（又叫皮肤过敏性抗体）特点之一，是能固定在同源或密切相关种的皮肤及其它组织上（如：肺、结肠）。由于猕猴同人在种的发生上有近缘关系，所以它们能用过敏人的血清引起P-K反应（Prausniz-Kusrner）。在灵长类中，狒狒、猕猴、狨猴、卷尾猴、狐猴是人类过敏性患者反应素抗体引起的萎缩性多软骨炎（PCA）的最好接受者。一些学者证明，灵长类动物是人呼吸道变态反应病的动物模型。

（二）狗

狗的免疫球蛋白有IgG、IgM、IgA、IgG₁和IgG₂。在狗花粉病和各种蠕虫感染中发现有IgE。Patterson氏等指出成年狗对各种蛋白抗原只产生少量的循环抗体。胎儿和新生狗也有类似情况。

Lewis等认为新生狗和成年狗对颗粒性抗原（绵羊红细胞）均能产生较好抗体，但新生狗初次免疫反应所产生的抗体几乎是IgM类，成年狗则产生的抗体是IgM和IgG，这两种免疫球蛋白的数量与初生狗的IgM几乎相等。新生狗在再次反应中有合成IgG和IgM。

Gerber氏等报告了小猎兔犬（Beagle　Dog）循环的T淋巴细胞对PHA的反应，6-12周龄比0-4周龄显著为多。对PHA发生反应的高峰在6周到6个月龄之间，以后随年龄而下降。小猎兔犬在出生时的胸腺大约为100mg，到12周龄增加到300mg以上。白细胞总数随年龄增加而逐渐减少。

狗除用作一般移植研究外，越来越多地作为免疫病研究的动物模型。除人之外，对气溶胶出现变态反应的动物，狗大概是仅有的一种。因此，人的变态反应和气喘的研究，狗是适宜的动物模型。人花粉病的临床表现为结膜炎、鼻炎和皮炎，狗季节性花粉病多数只有皮炎，无眼和呼吸道症状。人的这种变态反应是由IgE引起的，狗由豚草花粉（Raweed　Pillens）致敏后，血液和皮肤中也有IgE抗体。

（三）兔

兔常被用于实验室制备抗体，多用新西兰色。由于所用兔的品系、品种、种和个体的不同，对某种抗原产生抗体的能力也经常不同。有些品系的兔，至少有20%产生的抗体效价或无效价，为了得到高效价的血清，10只兔作为一组进行免疫要必要的。

兔肠道淋巴组织由派伊尔氏淋巴集结，圆囊（在回盲肠连接处的集合淋巴小结）和阑尾构成。Waksman氏等叙述了淋巴细胞组织中形态和机能不同的三个部分：圆体（Dome）含有原始和成熟的B淋巴细胞；冠（Corona）含有小淋巴细胞胸腺依赖区含有后毛细菌小静脉、滤泡。他认为圆体可能相当于囊淋巴器官，能产生B淋巴细胞。滤泡是一种非特异性的B细胞大量增殖（扩大）的器官。集合淋巴小结、圆囊和阑尾都含有T细胞，T细胞经过后毛细胞管静脉到达阑尾。集合淋巴结和阑尾内还同时存在着B细胞，但没有抗体形成细胞。这种界线分明的T、B淋巴细胞系统及B细胞迅速地增殖和迁移（肠道淋巴器官中，B细胞参加免疫反应，但不长久停留）可能使肠道局部缺乏免疫反应。集合淋巴小结是产生IgA细胞的重要来源。

兔的IgA大量存在于肠粘膜和初乳中，这种分泌型抗体的合成是在肠、乳房和支气管腺体间质的浆细胞以及脾和淋巴结中。

兔的反应素抗体相当于人的IgE。兔的IgM能增强反应素的形成，而IgG能抑制反应素抗体的生成。

兔被用来作过敏反应的研究。IgG和IgE引起的过敏反应，临床症状相似，机理都是抗原-抗体结合和血小板-白细胞凝集形成沉淀物，释放药理活性物质（组织胺和5-羟色胺）进入肺循环，在右心的出道中产生一种机械和药理的联合作用，导致循环性虚脱。IgG诱发血小板或嗜碱性的细胞释放影响血管的胺要依赖补体的作用，而IgE诱发释放的胺不依赖补体。

（四）豚鼠

豚鼠中已确定的免疫球蛋白有：IgG(IgG₁、IgG₂)、IgA和IgE。IgG₁是变态反应的媒介，IgG₂与小鼠的IgG₁和IgG₂相似，在抗原一抗体作用中起结合补体的作用。

豚鼠除作为补体的来源外，已广泛用于免疫的发生和迟发型变态反应的研究。近新繁殖的豚鼠2系和13系常被用于免疫学研究。这两个品系对特异性抗原产生的免疫反应有显著不同。例如，当给豚鼠2系和13系注射含有相同抗原的福氏（Freund）完全佐剂时，豚鼠2系（和一些Hartley系豚鼠）表现明显的迟发型变态反应，对DNP-PLL（二硝基苯－多－L－溶解素）产生高浓度的抗体，而豚鼠13系不出现免疫学反应。另一方面，豚鼠13系和Hartley系豚鼠对联胺嗪（Hydralazine）都能产生抗体和迟发型变态反应。豚鼠2系仅呈现弱反应或无反应。

豚鼠的皮肤已被用已结核菌素的皮内试验和接触过敏物质的迟发型变态反应的研究。豚鼠和人的结核菌素反应差别是有无细胞浸润，另外豚鼠的迟发型变态反应在24-48小时达到高峰，人在48-96小时达到高峰；人和豚鼠接触敏感的化学物质引起的变态反应，细胞反应非常相似，而对皮内接种抗原的反应却有明显的不同，豚鼠比人有更多的白细胞和巨噬细胞对抗原起反应。

当进行免疫学研究选择豚鼠时，应特别注意机体本身的因素，如：年龄、体重、饮食和遗传因素。Baer氏等认为2-3月龄或体重为350～400克的豚鼠作迟发型变态反应最合适。豚鼠13系对结核菌素型变态反应比豚鼠2系敏感。相反，豚鼠2系对接触性过敏反应比豚鼠13系敏感。Hartley系豚鼠对结核菌素型变态反应和接触反应皆敏感。这些现象说明抗体发生迟发型变态反应的能力同样也处于基因的控制之下。

最近，一些学者以豚鼠作为研究过敏或速发型过敏反应的实验模型。在全身变态反应中，肺是休克器官，肥大细胞是靶细胞，组织胺是主要的药理价质。在豚鼠在两种类型的变态反应抗体，即IgG1和IgG2。

Recently　Arko报导，在进行淋病研究中使用的实验动物，豚鼠是最令人满意的免疫学模型。豚鼠象人一样具有延长和限制迟发型真皮变态反应显现的能力，这种现象常作为肿瘤免疫的指标之一。

（五）仓鼠

Coe氏等研究了Syrian仓鼠的免疫反应，发现有电泳快的（IgG1）和慢的（IgG2）两种TS亚类免疫球蛋白。当以鸡蛋白盐水作为抗原，接种仓鼠，仓鼠产生IgG1；若将鸡蛋白与福氏佐剂一起接种仓鼠，则能产生IgG1和IgG2。仓鼠的IgG1能诱发PCA反应，不能产生全身过敏反应。Coe氏等认为这可能是由仓鼠在变态反应中缺乏必要的影响血管的胺的缘故。仓鼠的IgG2能固定补体，并在豚鼠中诱发PCA反应，IgG1不能固定补体。

（六）小鼠

小鼠的免疫球蛋白有IgM、IgA、IgE、IgG₁、IgG₂a和IgG₂b。近交系小鼠对不同抗原的免疫反应是在常染色体的遗传控制之下，这种常染色体上有支配免疫反应的基因（Ir），基因连接在主要组织相容位点（H-2）上。基因Ir好象同T细胞的机能有关系，与B细胞的关系不大。

小鼠虽然能产生迟发型变态反应，但很少见到典型的表皮反应，也不象其他动物那样有规律。小鼠能被诱发产生速发型变态反应，它的全身性过敏反应的特点是循环不畅，循环性虚脱，常在几小时甚至10到20分钟死亡。在体外过敏反应实验中，只有小鼠子宫能用来作Schultz-Bale反应。小鼠的IgG和IgE能使皮肤致敏，引起被动真皮过敏反应。诱发小鼠的Arthus反应比较困难，既使发生，与其他实验动物（如兔）相比也不那么激烈。小鼠不象大鼠和豚鼠那样，以福氏完全佐剂接种不小鼠的脊髓或脑内很难诱发实验性变态反应脑脊髓炎（EAE），用主要组织相容性综合体不能控制小鼠对实验性变态反应脑脊髓炎的感受性。

（七）大鼠

在大鼠中，连接在主要组织相容综合体（H）上的免疫反应基因（Ir）控制着对GT（L-谷氨酸和L-酪氨酸）和GA（L-谷氨酰胺和L-氨基丙酸）的免疫反应，豚鼠与其相似。

大鼠和豚鼠的免疫反应基因lr控制着体液抗体反应和细胞免疫。已经证明，大鼠对绵羊细胞（SRBC）和牛r球蛋白（BGG）的免疫反应有品系的差异。

大鼠有反应素抗体IgE，蠕虫感染常能诱发大量的IgE抗体，它们存在于血液循环之中。常规的免疫法只能使大鼠产生少量反应素，在体内存在的时间较短。有些品系大鼠，如Hooded　Lister和Spragus-Dawley，能产生较多的IgE，再次注射抗原，IgE也随之上升。百日咳菌免疫大鼠主要产生IgE，如在此抗原中加入福氏完全佐剂，免疫大鼠则产生IgGa。

（八）猪

已经知道猪有三种免疫球蛋白，即IgG（IgG₁和IgG₂）、IgM和IgA。猪初乳中的免疫球蛋白主要是IgG（其中IgG1为主），其次是IgA。泌乳2-3天后，乳中IgG和IgM迅速下降，但IgA的量仍保持相对稳定。

猪的IgA同人的IgA有交叉反应。IgA有单体和存在于分泌中的双体两种，它们分别为7s和10s。肠道固有层中包含着多量分泌IgA的浆细胞。

（九）反应动物（牛、绵羊、山羊）

反刍动物已经确定的免疫球蛋白有IgG（IgG₁和IgG₂）、IgA、IgM和类似IgE。同其它动物一样，IgG是主要的免疫球蛋白，IgG₁能固定补体（IgG₂不能），并能选择性从血清到乳汁中去，所以初乳和常乳中IgG₁是主要的免疫球蛋白（75%），而IgA和IgM仅占初乳抗体的20%。这些初乳中的免疫球蛋白对于幼畜的存活是非常重要的，它们能协助胃肠道预防感染。

Silverstein氏等研究了羊免疫反应的个体发生，发现不同日龄的胎儿对抗原的反应有显著差别。41天的胎儿对细菌噬菌体×174能产生抗体，56天的胎儿对铁蛋白能产生抗体，80天的胎儿对血清蛋白能产生抗体，120天的抬儿对卯清蛋白能产生抗体。胎儿对卡价苗、伤寒沙门氏菌或白喉杆菌病毒没有反应，羊胎儿对抗原同样会产生典型的初次抗体反应。

四、近交系动物在免疫研究中的应用

（一）自身免疫性疾病

自身免疫性疾病主要的发病机理是免疫复合物造成的损害，如系统性红斑狼疮（SLE）、肾炎、类风湿性关节炎等，已知抗体起作用的疾病有重症肌无力、甲状腺机能亢进症等，此外还有一些目前不清楚的免疫病，即对其抗原和抗体的免疫反应性都不清楚，这些病研究起来比较困难。由于免疫复合物病有较好的动物模型，研究起来就方便多了。

1．研究感染与自身免疫病的关系。

纯系新西兰黑色小鼠（New　Zealand、Black,NZB）在出生后4-6个月大多数发生自身免疫性溶血性贫血。免疫学检查表明，其红细胞表面有自身抗体，血清中有抗核机体，病鼠的淋巴结、胸腺、脾脏及胰腺内可以查到C型致瘤RNA病毒（此病毒还能引起白血病）。将含有此病毒的组织输给（NZB×BALB/c）F₁时，能引起抗核抗体的生成和肾小球肾炎。据推测，当宿主细胞受到病毒感染后，释放出DNA，刺激免疫系统生成抗DNA自身抗体，此抗体与游离的DNA结合，形成免疫复合物沉积在肾小球基底膜上，引起肾小球肾炎，因此认为本病是由于这种病毒感染所触及的。此外，还发现约有50%的病鼠有抗自身T淋巴细胞的抗体，且其出现频率随鼠龄增加而升高，这种自身抗体能与正常鼠及病鼠的T细胞发生反应，引起T细胞（包括抑制性T细胞）减少或功能衰退，结果，B淋巴细胞乃生成大量多种自身抗体。人的系统性红斑狼疮与NZB小鼠的这种自身免疫病十分相似，也能在淋巴样组织中查到C型RNA病毒颗粒，其T淋巴细胞也能释出病毒颗粒，也能查到抗自身T淋巴细胞的抗体（约占一半病例）而且病理变化也基本上与NZB小鼠的这种自身免疫病相同。

除了NZB小鼠的自身免疫性溶血性贫血以外，阿留申貂脑病（一种脑的退行性变性病）、小鼠的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、羊的瘙痒病（skrapie）、马的传染性贫血也都是由于慢性病毒感染引起的自身免疫病。人的Kuru病与羊的瘙痒病、阿留申貂脑病相似，Kurn病只见于新几内亚的高尔族人，尤其是女人，她们有吃人肉的风习，自从禁止了这种风习以后，此病的发病率明显地下降了。

2．研究自身免疫性疾病与遗传的关系

进行动物自发的自身免疫病的遗传学分析对于了解遗传因素在人类自身免疫病中的作用很有帮助。如（NZB×NZW）F1小鼠由于MHC决定的抑制性T细胞功能丧失或减退，能自发地发生与人的系统性红斑狼疮十分相似的自身免疫病，因此，一般认为它是人类自身免疫病的最佳天然模型。用系内同代互交和回交法可以推断：最低限度有三对等位基因控制免疫系统对自身抗原的反应；控制抗红细胞抗体生成的基因可能不同于控制抗核抗体生成的基因。这种推断也在一种莱克享有纯系鸡的自身免疫性甲状腺炎的遗传学分析中得到了证实。这种鸡的自身免疫性甲状腺炎的发病受Ir基因控制，它们缺乏控制性T细胞的功能。所以，B淋巴细胞能生成大量抗甲状腺自身抗体，通常这种鸡在孵出后二周即可查出抗甲状腺抗体，几个月后出现嗜睡、羽毛生长障碍，最后出现肥胖症及甲状腺机能低下的症状。如果在刚孵出时切除腔上囊，则可使这种甲状腺炎的发病率减低，或使其病情减轻，抗甲状腺抗体的效价下降。

3．研究胸腺功能低下与自身免疫病的关系

将新生小鼠摘除胸腺，造成T淋巴细胞缺乏的状态，可见小鼠逐渐地发生消耗病（Wasting　Discase），其主要表现是体重下降，腹泻、反复发生感染。有些小鼠发生了与人的SLE相似的自身免疫性溶血性贫血、皮疹、肝炎及肾小球肾炎。但是，如果把去胸腺小鼠放在无菌环境中饲养，就不发生上述自身免疫性疾病。这说明对于自身免疫性疾病的发生来说，胸腺机能低落是重要的内在因素，而微生物的感染等则是重要的外界因素。又如，给新生的NZB小鼠摘除胸腺后，该小鼠的自发性自身免疫病加速发展，并迅速地出现溶血性贫血，血清中出现抗体DNA抗体、抗DNA组蛋白抗体、LE细胞及免疫复合物性肾小球肾炎。但是，如果把幼小无病的NZB小鼠的淋巴细胞输给这些小鼠，则可防止自身免疫病的发生，反之，如果病鼠的脾细胞（含T淋巴细胞在内）输给幼小无病的NZB小鼠，则小鼠将迅速持续地合成自身抗体。这些实验结果提示：胸腺功能衰退引起抑制性T淋巴细胞缺乏，与自身免疫病的发生之间有着密切的关系。与此相似，给刚刚孵出的莱克享肥鸡摘除胸腺时也能加重其日后出现的甲状腺功能低下。现在知道：胸腺功能正常是T淋巴细胞的正常分化、成熟所不可缺少的。如果胸腺功能减退，则胸腺激素的产生必然减少（事实上，SLE病人及NZB病鼠血中的胸腺激素水平是低的），故T淋巴细胞，包括抑制性T淋巴细胞的分化、成熟将发生障碍（停滞），结果，对自身抗原有反应能力的B淋巴细胞将不受遏制地产生大量自身抗体。

4．研究红斑狼疮疾病

对人的系统性红斑狼疮（Systgmic、Lupus　Erythematous,SLE），长期以来一直使用有自发类似狼疮性肾炎疾病的B/WF1（NZB×NZWF1）小鼠作动物模型，研究病因和治疗方法，取得了很多资料。最近美国杰克逊实验室的Murphy医生，建立培育了有自发性红斑狼疮的MRL/MP/lprl(MRL/L)小鼠和BXSB小鼠（只有雄性鼠发生早期狼疮肾炎），用这些小鼠研究，得到了新的见解，重新评价了狼疮肾炎的发病机制。

现在至少有十几个品系的小鼠可以自发产生与SLE类似的自身免疫病，文献中报导的主要有四个品系，它们有各自不同的表现（见10-5、6）。表10-5中四种小鼠都是到一定年龄时发生SEL，表现为抗体上升，免疫复合物增多，肾炎，而后逐渐死亡，可是它们还有不同的发病特点，例如NZB小鼠主要还有较多的抗红细胞抗体，而MRL/L基本没有；MRL/L有类风湿因子、关节炎、淋巴组织增生，其它小鼠没有等。所以NZB可作为免疫性溶血性贫血的最好模型，MRL/L是研究类风湿的模型，NZB/W可以作为SLE的最好模型。此外值得注意的是胸腺对发病的影响也不同。幼小时切除胸腺，NZB/W的病有增加，说明切除胸腺后T细胞的抑制性降低，B细胞亢进，MRL/L去胸腺后不得病。

表10-5　四种SLE品系小鼠的表现

指标	MRL/L	BXSB	NZB	NZB/W
去　胸　腺	抗病	-	加重	加重
抗自身红细胞	0	+	++　+　+	++
类风湿因子	+	0	0	0
关　节　炎	+	0	0	0
淋巴组织增生	卅	++	+	+
T、B细胞	T↑	B↑	B、T↑	BT、↓

表10-6　四种SLE品系小鼠自身混合淋巴细胞培养结果

小　鼠　品　系	年龄（月）	转化细胞渗入3H-TdR(Pm×10­3)
		自　发	PHA刺激后
C57BL／6	2	2.5	11.7
CBA	2	1.7	13.6
NZB／W	7	5.2	2.9
MRL／L	3	4.4	3.0

表10－6中四种小鼠的自身淋巴细胞混合培养反应性也不一样，说明它们的细胞本身有病变，不单有抑制性T细胞异常。

几种SLE品系小鼠的主要免疫学特性：

⑴NZB系：

来自N20第三代中的一对黑鼠。H-2d，淋巴细胞表面同种抗原（Thy-1.2,Ly-1.2,Ly2.2,Ly3.2,Qa-1a,Mlsa,Tlau）,

①有自身免疫性溶血性贫血症：在4-5月龄以前Ht　值平均为44%，以后伴随增龄而下降，14月龄为32%，母鼠在6月龄后，公鼠在8月龄后出现Coombs氏试验阳性，伴随增龄阳性化率增高，10月龄为50%，12月龄以后达100%。自6月龄起出现抗核抗体。老龄小鼠出现红斑狼疮细胞。

②有高血清免疫球蛋白病：血清免疫球蛋白量异常之高，特别是IgM和IgG量递增。IgM量在一生中递增，其递增与性别、病情及Coombs氏试验都无关，并不因无菌饲养或初生期摘除胸腺而减少。血清中有抗2-和3-硝基酚抗体，且效价高。

③有类狼疮性肾炎：8月龄以后的小鼠自发与人的狼疮肾炎相似的以肾小病变为主的肾病变，并感染C型病毒。肾病变的为免疫复合物沉着所致。

④有特殊的胸腺病理组织学变化：伴随增龄胸腺重要较其它近交系小鼠为早期减小，髓质中形成淋巴滤泡，上皮细胞增殖，皮质中浆细胞和肥大细胞浸润。该现象与2～3周龄后出现的抗胸腺细胞自家抗体有关。

⑵NZW系

H-22，淋巴细胞表面同种抗原（Thy-1,2）。NZW与NZB杂交仔一代动物B/WF1（NZB×NZWF1），有自发的类似狼疮性肾炎、红斑狼疮细胞（LE细胞）阳性和抗核抗体阳性。

⑶BXSB系

来自C57BL/6J×SB/leF1，H-2b,淋巴细胞表面同种抗原（Thy-1,2、TL-、Ly-1,2、Ly-2,1,Ly-3,1、Qa-1b），抗自身红细胞阳性，淋巴组织增生，B淋巴细胞增多。

⑷MRL/1系

MRL/1小鼠是由C57BL/6J（H-2b）、C3H/Di(H-2k)、AKR/J(H-2k)及LG/J(H-2b)四个品系反复杂交育成的白化小鼠。从交配的过程推断，基因组成是LG75%，AKR12.6%,C3H12.1%,C57BL/60.3%。同种抗原和表现型是H-2k,Lyt-1.2+,　Lyt-2.1+,Lyt-3.1+,Lyt-1.2+,TL-。IgG2a的同种异型为a。其它免疫学特性有：

①有全身性淋巴结显著肿胀：3月龄时肿胀明显可见，交随日龄增长而增大。

②有肾炎及血管炎、多呈急性或亚急性肾炎和多发性血管炎。4-5月龄时，用荧光标记可见抗IgG和C3抗体。在肾小球的肾毛细血管壁和肾小球膜上，能明显检出免疫复合物。血管内皮细胞和肾小球膜增殖，基底膜肥厚，有蛋白样物质沉着，类似人的狼疮肾炎。

③有类风湿关节炎：类似人的类风湿性关节炎，20-25%的MRL/1小鼠有关节软骨破坏，滑膜增厚，形成血管翳，渗出液贮留等类似人的类风湿关节炎的病状。

④有高免疫蛋白及补体减少：血液中免疫球蛋白量常呈高值、5月龄时达MRL/n小鼠的5倍，4～5月龄鼠的IgG达26mg/dl，约为正常小鼠的6-7倍。分类测定的结果是：IgA、IgM、IgG2b为正常小鼠的2倍，IgG1、IgG2a为6倍。血液中补体效价随月龄增长而下降。

⑤有半抗原抗体及自身抗体等。2-3月的MRL/1小鼠，在血清中检出抗2-硝基酚和抗3-硝基酚抗体。抗单链DNA抗体也在2-3月龄时被检出并随日龄而升。抗双链DNA抗体、抗Sm抗体；抗核糖核苷蛋白（RNP）抗体，抗ATP抗体等各种抗核成分的抗体效价也上升。

⑥有免疫复合物。血液中的免疫复合物可用多种方法检测到，MRL/1小鼠比其它狼疮小鼠的检出效价都高。免疫复合物与狼疮肾炎和血管炎都有直接关系。

⑦有淋巴细胞异常变化：MRL/L小鼠脾脏和淋巴结内Thy-1阳性的T淋巴细胞异常地增殖，4月龄以上小鼠的脾脏有70-90%，淋巴结有95%以上是Thy-2阳性细胞。自身免疫病小鼠的T细胞对刀豆素A的反应下降，而且用刀豆素A诱导，产生白细胞间介素Ⅱ的能力也下降。自发性狼疮肾炎小鼠的抗半抗原抗体，抗单链DNA抗体及产生免疫球蛋白的细胞增多特征为在初期是IgM型，而4月龄时则以IgG型为主，产生免疫球蛋白的细胞增多与肾炎的发展的有密切关系。

⑧免疫反应下降：对绵羊红细胞的一次及二次抗体反应答反应随月龄增长而显著下降。在2月龄时可查出对DNP－－卵蛋白元的一次和二次IgG及IgE的应答反应，而到4月龄时就查不出的这些抗体了。

（5）MRL/n系

MRL品系小鼠在近交12代时发生常染色体隐性突变成两个亚系，其一具有lpr(lyromephoproliferative,淋巴增生)基因称MRL/1亚系，另一个则无此突变称MRL/n亚系。MRL/1小鼠因第5染色体上有lpr基因，2月龄时除发生全身性淋巴肿瘤外，并出现早期狼疮性肾炎，5-6月龄时半数死亡。疾病的发展比B/WF1小鼠快，所以使用价值也大。而MRL/n小鼠缺乏lpr基因，仅迟发轻度肾炎。Lpr基因为常染色体的劣性基因。把这基因导入其他小鼠，也能出现MRL/1小鼠的各种症状。

5．研究自身免疫病时的免疫病理特点

⑴多种自身免疫反应及其它免疫反应特点

共有的血清学特点为：高丙球蛋白血症、抗核抗体、抗dsDNA、抗SS-DNA、抗决定基抗体、高水平gp70、免疫复合物与补体水平降低（NZb　C5缺乏）。

不同的特点为：出现抗Sm为MRL/n、MRL/1鼠系；出现IgG和IgMRA和关节炎的为MRL/1鼠系；出现抗红细胞抗体者为NZB、NZBXW鼠系；出现NTA者为NZB、NZBXW、BXSB鼠系，T细胞升高者为MRL/1鼠系，B细胞升高者为BXSB鼠系♀，B细胞及T细胞下降者为NZB鼠系♂、NZ鼠系。

⑵免疫复合物的致病作用

在小鼠SLE中，gp70-抗gp70的免疫复合物（IC）在伴随SLE的肾炎中起重要作用。在这类小鼠中15-30%具有急性或陈旧性心肌梗死或退化性血管病，此乃由于IC沉积于心肌血管所致。唯独MRL/1部分小鼠可发展为急性或坏死性关节性，甚至所出现的各种病变与类风湿关节炎十分类似。

⑶多株B细胞的高反应性

用三种方法测定出B细胞功能增高的现象；

①测定Ig分泌细胞及细胞（脾）质内Ig含量（免疫荧光法）细胞数量皆增高；②所有SLE鼠系脾脏抗三硝基苯（TNP）空斑形成细胞（PFC）皆含有较高水平的抗TNP结合SRBC的抗体；③鼠脾脏B细胞集落数目增多，B细胞的活跃尚表现于高丙球蛋白血症中；表现出对T-依赖性抗原去凝聚BGG及HGG的免疫耐受有抵抗力。更值得注意的是，MRI/1及雄性BXSB小鼠较正常MRL/n及雌性BXSB小鼠对免疫耐受性无抵抗力，容易诱导成功。有关全身B细胞活性增高和过度产生自身抗体的准确机制尚不清楚，但推测有可能是由于内源性或外源性B细胞激活、缺乏抑制T细胞负作用、增强辅助T细胞正反应、T调节细胞的亚类缺乏或缺乏免疫系统的其它成分如巨噬细胞等所致。但是，目前大多数认为B细胞的活性增高是与全身性T细胞的调节缺陷无关。

6．研究T及B细胞在自身免疫病的作用

通过实验动物模型研究证实自身耐受特别是T、B细胞的耐受（即对某一特定抗原无反应性）是引起自身免疫病发生的中心问题，虽然抑制细胞有时与耐受状态有关，但并非是诱导和保持耐受的原因。成年动物亦常会由应用无免疫原性抗原（可溶性或称去凝聚的蛋白质）引起耐受。诱发T、B细胞的耐受原的量具有很大不同，T细胞的耐受原量要比B细胞少得多，如小量抗原引起T细胞耐受时，B细胞仍旧活跃，并未诱导出耐受。例如在体内细胞外存在的低浓度自身抗原如甲状腺球蛋白、某些种类Ig或生长激素，皆可使T细胞产生耐受，而B细胞则不产生耐受，体内高浓度的血清白蛋白则可同时引起T、B细胞耐受。但是尚有一些存在于体内的很低浓度的抗原如碱性蛋白、细胞色素C、独特型决定簇等对T、B细胞皆不能引起耐受。总之T、B细胞的耐受程度是依赖于其微环境中自身抗原的浓度。

根据T、B细胞对自身抗原的免疫状态，实验性自身免疫疾病有以下结论：（1）实验性自身免疫甲状腺炎、EAT：T细胞耐受，B细胞激活；（2）实验性变态反应脑炎：直接激活活性T细胞；（3）实验性自身免疫重症肌无力、EAMG；T及B细胞皆激活；（4）类风湿性关节炎：单克隆B细胞激活。

（二）高<或低>免疫球蛋白血症

免疫球蛋白的变化对分析免疫反应极为重要，各种免疫蛋白（Ig）都具有一定的结构、特点及较稳定的数值，它是了解Ig各种免疫功能及免疫反应作用机制的物质基础。

人类和哺乳动物的血清中含有成千上万种免疫球蛋白，每一种免疫球蛋白分子的氨基酸排列顺序都不一样。按其理化、生物学及免疫特性可分为免疫球蛋白G、A、M、D、E五种。而IgG又可分为四个亚型，IgA分为三个亚型，IgM分为两个亚型。

小鼠免疫球蛋白中已知有IgM、IgA、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，其中IgE和IgG3正常小鼠血清中含量甚少。小鼠各类Ig的数量因品系不同而差异很大，因此了解用于实验的小鼠Ig的情况很重要。现将几个常用小鼠品系的各类Ig情况介绍如下：

1．IgM:在3月龄以前BALB/C、C3H/He、C57BL/6三品无差异，为200μg/ml左右。BALB/C在三个月以后也无多大变动。但C57BL/6随增龄而增加，生长一年雌性和雄性都超过500μg/ml，C3H/He伴随增龄也有一定程度增加，但其程度不如C57BL/6。此外，N2B呈高值，并出现IgM的巨球蛋白血症，CBA/N呈低值，出现IgG缺乏症。

2．IgA：BALB/C一月龄已呈高值，为C3H的2倍，C57BL/6的10倍。BALB/C、C3H/He和C57BL/6都随增龄而增加，尤以BALB/C为著，BALB/C在6月龄后，超过1000μg/ml的个体很多，8月龄全部超过1000μg/ml。皮下移植106IgA的浆细胞瘤细胞20天后，IgA量为2～3mg/ml左右，正常BALB/C超过1000μg/ml的个体可视为免疫球蛋白过多症。正常BALB/C最高值时（20月龄）也仅为200～300μg/ml，与BALB/C相比呈低值，C57BL/6伴随增龄缓慢增加，平均值不超过1000μg/ml。与雄性相比，BALB/C的雌性呈高值，其它品系无一定倾向。BALB/C的IgA呈高值，与BALB/C小鼠腹腔内注射矿物油后所生浆细胞瘤的60%为IgA合成株的现象有关。

3．IgG₁：C3H/He在3月龄以后下低，但BALB/C在3月龄以后仍然增加，和IgA相同，6个月龄以后几乎全部超过1000μg/ml。C3H/He在20月龄时为200μg/ml，降低到3月龄时1/5左右。C57BL/6为低值，但伴随增龄而缓慢增加。在IgG的亚型中，IgG1呈高值的品系有DBA/2，SJL和NZB。

SJL伴随网状细胞瘤而产生的单克隆性M成份，大部分为IgG，其中IgG1最多。在DBA/2×CBA杂交子一代，即使自然发生的浆细胞性白血病也几乎都是IgG,IgG1仍为最多。据报导IgG1难建立免疫耐受性，在SJL、BALB/C、NZB等品系难以建立免疫耐受性。

4．IgG2a：C3H/He6月龄以前呈高值。BALB/C在8月龄时呈短暂高值，在其它时期，看不到象IgA和IgG1那样与其它品系小鼠的显著差别。C57BL/6与C3H/He相比为低值，但随增龄而缓慢增加。

5．IgG_2b：BALB/C在8月龄时有一定增加，但在其它时间里几乎没有变动，为100～300μg/ml，在IgG的亚型中为最低值，C3H/He也看不出随龄而引起的变动。C57BL/6伴随增龄而增加，在IgG的亚种中为最高值，在12月龄以上的个体中有超过1000μg/mg者。

从上可知小鼠Ig含量多少因品系不同而差异很大。BALB/C的IgM和IgG2b为低值，IgG1和IgA为高值。然而C57BL/6则相反，IgG1为低值，IgG2b和IgM为高值。C3H/He的IgA为低值，IgG2a为高值。NZBIgM呈高值，出现IgM的巨球蛋白血症，CBAIgM呈低值，出现IgM缺乏症。

（三）各种免疫缺陷病和过敏症

1．补体（C′5）功能缺乏症：C5缺乏可使血清的调理作用失调，导致中性多核白细胞的趋化、吞噬及杀菌作用的无能，容易反复感染病菌。AKR/N和BIO、DZ/DSnN品系小鼠补体5缺损，易发生先天性补体C5功能缺乏症。DBA/2N品系小鼠补体C5活性低，相反BALB/CAnN品系小鼠的补体C5活性高。

2．迟发型超敏反应：迟发型超敏反应中包括结核菌素超敏反应，Jones-Mote型皮内过敏反应和接触性过敏症等。不同近交系小鼠的反应性有很大差异，如用纯蛋白衍生物（PPD）作抗原时，其足垫反应明显的近交系有：ICR，BALB/C，C57BL/6，DBA/2，C3H/He；反应稍弱的近交系为CFW，CDF1；反应弱的近交系为NZB，C57L，CBA；HR/Jms是反应最弱的近交系。如用绵羊红细胞（SRBC）作抗原时，不同近交系小鼠迟发型超敏反应也有较大差异，SWM/Ms、ddN、DDy是高反应的近交系；ICR、DDD、BALB/C（♀）为较高反应的近交系；C57BL/6J，C3H/He、DBA/2（♂）是低反应的近交系。

第五届国际免疫学会议重点研究讨论了速发型超敏感性的机理和调节。Sehon介绍了他的实验室用B6D2F1系小鼠做的工作。将变应原如卵青蛋白等与单丁氧聚乙二醇（mPEG）共价偶联后可抑制IgE的生成而不影响其他类抗体的水平。关于mPEG结合物用于治疗IgE介导的过敏性疾病的实用价值，已有作者在豕草和蜂毒过敏的病人中做过一些尝试，初步结果是令人鼓舞的。Sehon认为mPEG结合物不仅可用于Ⅰ型变态反应性疾病的治疗，而且可用于许多需注射异种蛋白质的疾病；如器官移植时为防止排斥作用而注射鼠或大鼠抗T细胞的单克隆抗体等。

K.Ishizaka介绍了他们实验室过去5年研究IgE应答的类特异性调节作用，在感觉巴西日园线虫的大鼠以及最近建立的能分泌IgE结合因子的大鼠－小鼠T细胞杂交瘤所作的工作。发现与IgE有亲和力的IgE-结合因子（IgE-BF）能选择性地调节IgE应答。他们将正常大鼠的肠系膜淋巴结细胞在体外培养时加入不同浓度的Cona　(1r或10r/ml)，经2-3天后取出此活化的细胞再加入IgE继续培养，发现两种浓度的ConA均能诱导产生IgE-BF，但IgE-BF的性质不同。低剂量Cona　所诱导产生的大部为IgE-抑制因子（IgE-SF），高剂量ConA诱导产生的大部为IgE-增强因子（IgE-PF）。前者不能与扁豆外源凝集素结合，能选择性地抑制IgE应答；后者能与扁豆外源凝集素结合并能增强IgE应答，其分子上有含甘露糖的低聚糖。作者进一步发现原来每ml加入10r的Cona　IgE-PF，但在第二个阶段孵育时加入能抑制糖基化作用的蛋白质（Tunicamycin）后却改而产生IgE-SF。还证明福氏完全佐剂能促进产生IgE-SF，明矶能促进产生IgE-PF。这是由于前者能诱导产生糖基化作用抑制因子，而后者诱导产生糖基化作用促进因子。已知糖基化作用抑制因子系分子量为16000的多肽，可生成IgE-BF来调节IgE应答。Ishizaka希望对此课题的基础研究能开辟一条调节过敏病人IgE应答的新途径。

Katz过去证明在小鼠中有变态反应抑制因子（SFA）可抑制小鼠IgE的应答。在此次讨论中它以大量的实验证据证实了人SFA的存在。SFA能选择性地抑制IgE抗体合成。人SFA来自双向混合淋巴细胞培养（MLR）的上清液。测定系统是培养的人单个核细胞，于其中加入适量的PWM，在PWM刺激前一天加入MLR上清显著地抑制了淋巴细胞体外IgE的产生。Katz建立了一个敏感的放射免疫测定法，敏感度高达10pgIgE/ml。他的实验室已得到能产生大量人SFA的T细胞杂交瘤系，为研究人SFA的性质提供了方便，籍此采用遗传工程的方法将相应的转移到大肠杆菌，而生产大量的人SFA。

Kishimoto在已成功地建立了具有鼠IgE类特异性抑制功能的T细胞杂交瘤的基础上又建立了一些能分泌免疫调节因子的T细胞杂交瘤，并应用这个方法来克隆人IgE类特异性抑制性T细胞，初步结果表明已建立了能分泌IgE-抑制因子的T细胞杂交瘤。

Metzger进行了在IgF受体受到刺激后生物学方面的研究，发现一经改变了的抗体会使受体发生反应，而无须IgE的参与。

T.Ishizaka讨论了受体的搭桥及搭桥后膜止酶的活化。她的研究是鉴定与膜相关的那一个酶在Ca++涌入中所起的重要作用。用人的细胞进行此项工作受到细胞来源的限制。过去几年曾积极从事于建立人的嗜碱细胞和肥大细胞的体外培养，最近已能成功地培养人嗜碱细胞，使脐血的单个核细胞中的嗜碱细胞能选择性的生长。此项工作的要点是在全血培养中加入已除去IL-2的T细胞培养上清，经2-4周培养后有50-90%的细胞具有嗜碱细胞和肥大细胞的特点，但光学显微镜不能区分其为哪一种细胞，后经电镜观察证实为嗜碱细胞，因之称其为经过培养的嗜碱细胞。其表面标志为OKT3-、OKM1-、Thy1-，组胺含量为每100万细胞介于0.5-2.0r之间，每个细胞上约有12-38万IgE受体。此细胞与人IgE有高度亲和力，经人IgE致敏后用抗人IgE攻击可释放相当量的组胺。同时也发现此培养的嗜碱细胞不仅与人IgE结合，而且也可与小鼠和大鼠的单克隆IgE结合。小鼠IgE和人IgE结合到培养的人嗜碱细胞上的速率相似，只是小鼠IgE解离的速率较快。关于介质释放的启动机理仍有许多问题有待解决。但他相信有了大量有功能的可培养的嗜碱细胞，为进一步分析Ⅰ型变态反应性疾病所涉及的介质释放提供了一个有力工具。

Austen主要介绍最近几年对肥大细胞的新认识。已发现一个亚群的肥大细胞与一般含有肝素的结缔组织肥大细胞明显不同，它是受T细胞控制的。此第二类肥大细胞有产生白细胞三烯的独特能力，可能与粘膜上的肥大细胞是一致的。Austen将此类细胞称为E-肥大细胞，而将含肝素的称为H-肥大细胞。他发现，小鼠骨髓细胞在TH因子的控制下生成的肥大细胞在电镜下与一般的肥大细胞无差别。最近的研究是得知为维持此细胞或使此细胞分化增殖均需有IL-3（TH产生、分子量介于23000-29000的糖蛋白、等电点中性、活性很强、少量可使细胞分化），在小鼠骨髓细胞的培养中加入IL-3，于不同时间进行检查证实，8周后100%的细胞均具有IgE受体。

Austen还用同位素标记LTC4（白细胞三烯C4）检测证明，平滑肌上有LTC4的受体。由于了解到有第二类肥大细胞的存在以及对肥大细胞生物学的研究，使对速发型超敏反应的理解又前进一步。

3．X-连锁免疫缺陷：CBA/N小鼠有X-连锁免疫缺陷（X-linked　Immune　Defect），血清IgE水平很低，对某些抗原缺乏反应，如对胸腺信赖性（Thymus　Dependent:TD）抗原的IgE和IgG缺乏应答性等。CBA/N小鼠这种X-连锁对多糖抗原反应缺陷具有重要意义，可以选用CBA/N来研究人的X-连锁缺陷病（如Bruton氏丙种球蛋白缺乏症、Wiskott-Aldrich氏综合症等）。因此CBA/N小鼠是研究X-染色体对免疫功能的影响和B细胞的发生、功能、异质性的极好动物模型。

4．过敏症：LEW大鼠对实验过敏性脑脊髓炎敏感，极易感染诱发性自家免疫性心肌炎，对诱发自家免疫性复合性肾小球肾炎敏感。易感染实验过敏性脑炎和药理诱发的关节炎。AS大鼠易感染实验过敏性脑脊髓炎，对自家免疫性肾小球炎敏感。AUG大鼠对实验过敏性脑脊髓炎易感，对自家免疫性甲状腺炎有抗力。WAG大鼠对实验过敏性脑脊髓炎有抗力，有些大鼠携带防御右旋糖苷过敏反应的隐性基因dx,对诱发自家免疫甲状腺炎敏感。

人类的一些自身免疫病的动物模型可参看表10-7。

表10-7　人类自身免疫性疾病的动物模型

疾　病	可能的抗原	动　物　模　型
自身免疫性溶血性贫血 特发性血小板减少性紫癜	Rh、I、i、P 血小板膜	用李斯特单核细胞增多症菌免疫家兔、NZB小鼠、狗。
感染性脑脊髓炎 外周神经炎	中枢神经系统脑磷脂 外周神经髓磷脂	实验性变态反应性脑脊髓炎 实验性变应性神经炎
肾小球肾炎	肾小球基底膜，可能与链球菌抗原发生交叉反应	基底膜+福氏佐剂可引起羊肾炎、马杉肾炎
淋巴细胞性甲状腺炎	甲状腺球蛋白微粒体抗原，第2胶质抗原	肥鸡的甲状腺炎 变态反应性甲状腺炎
肝斗性肝硬化 溃疡性结肠炎	线粒体、胆管上皮细胞 结肠粘膜上皮细胞	用家兔抗线粒体抗体可造成大鼠的肝胆系统损伤。 用结肠上皮细胞或肠道上皮细胞免疫家兔及大鼠
交感性眼炎 水晶体葡萄膜炎 天疮疮 重症肌无力 部分男性不育症	葡萄膜抗原（色素？） 水晶体蛋白 皮肤的复层磷状上皮细胞间桥抗原 横纹肌 精子	同种葡萄膜组织加佐剂引起豚鼠发生本病。 在多种动物可造成变应性葡萄膜炎。 家兔模型 用肌肉抗原与2-硝酸复合物免疫家兔 实验性自身免疫性无精子生成症

（四）其他免疫性疾病

BUF大鼠：36周龄的雄鼠有自家免疫性甲状腺炎，大于一年龄的动物有26%发生自发性自家免疫性甲状腺炎和甲状腺单核细胞浸润。食入3-甲基五环碳氯化合物后能自发地发生自家免疫性甲状腺炎，而新生期胸腺切除后其发生率几乎达到100%，对绵羊红细胞缺乏免疫反应。

DA大鼠易患自家免疫性甲状腺炎。

PVG大鼠对诱发免疫性甲状腺炎有抗力。易感染溶组织阿米巴病。WAG大鼠对实验过敏性脑脊髓炎有抗力。有些动物可能携带防御右旋糖苷过敏反应的隐性基因dx，对诱发自家免疫性甲状腺炎敏感。对铁缺乏敏感，且多肽类（TG）-Pro-L继发性抗体反应性低。

五、在移植免疫研究中的应用

转植健康的器官以取代有严重的不可逆性病变而丧失功能的器官，是治疗疾病的一项主要措施。早在第二次世界大战期间对烧伤病人就进行了异体植皮，然而，这种移植全部以失败而告终。原因何在？1943年Medawar为了查明异体移植失败的原因，在家兔身上进行了一系列实验研究，明确了异体移植失败是因为受者对供者的组织发生了免疫反应。1953年Gorer及Shell首次断定：小鼠的异体移植失败，关键在于H-2抗原不相容。不同近交品系小鼠有不同的H-2型，二个相同H-2型品系小鼠间移植，可不发生排斥反应。

（一）移植的类型

根据供者（Donor）与受者（Recipient）的遗传学关系可以把移植分为四种类型：

1．自体移植（Autograft）:为同一个体移植，如自体皮片移植。

2．同系移植（Isograft,Isogenic　or　Syngeneic　Graft,Congeneic　Graft）：为同系异体间移植，如基因完全的一卵孪生子之间的移植，近交系内不同动物个体（基因型很相似的）之间的移植。

3．同种异移植（Allograft,Allogenic　Graft,从前曾称为Honmograft）:为同种异体间的移植，如同一种内的不同个体之间的移植，如鼠→鼠。

4．异种移植（Xenograft,Xenogeneic　Graft,或Hetergraft），为不同个体间的移植，如不同种动物之间的移植，猩猩→人；猪→人等。

（二）动物对移植物的免疫排斥反应

受者的血管与供者的器官组织之间建立起血液循环之后，移植器官、组织的功能丧失，主要是由于免疫反应引起的损伤、坏死所致，其根据主要有以下几点：

1．给小鼠移植异系皮肤后，在头几天内受者的血管长入移植的皮片内，但从第3-4天起皮片内的血液灌流开始减少，皮片内的淋巴细胞及单核巨噬细胞浸润逐渐增多（浆细胞很少），并出现水肿、缺血、同时局部的引流淋巴结肿大，其内有大量淋巴母细胞的出现及核分裂。到了第9-10天以后，皮片发生坏死，脱落，这称为第一次排斥反应（First　Set　Rejection）。皮片脱落后，肉芽组织长入原来的移植部位，以后发生纤维化，形成疤痕；同时引流淋巴结也恢复原状。

2．如给该受者再次移植同一供者的皮肤，则在移植后的第3-4天提前出现排斥反应，而且强度比第一次强，血管很少或根本不长入移植的皮片内，皮片内很快地出现嗜中性白细胞、淋巴细胞及浆细胞浸润，并且血管内有血栓形成，这称为第二次排斥反应（Second　Set　Rejection,Secondary　Boosting）。

3．如受者第二次接受另一供者的皮肤移植，则不出现第二次排斥反应，而是出现第一次排斥反应。

4．如给新生小鼠摘除胸腺，则等到该小鼠长大后接近异系皮肤移植时，不发生移植排斥反应；但是如果给去胸腺小鼠注射同基因型的正常小鼠淋巴细胞时，则仍能发生移植排斥反应，这表明淋巴细胞在移植排斥反应中起决定性的作用。

5．将已经发生过移植排斥反应小鼠的淋巴细胞注射到另一同基因型正常小鼠体内，然后再进行异系植皮时，则发生第二次排斥反应，皮片提早脱落，这提示：被异系皮肤致敏的淋巴细胞具有免疫回忆功能，即在第一次排斥反应中有一部分致敏淋巴细胞以回忆细胞的形式持续存在于小鼠体内。

6．在发生过移植排斥反应的小鼠血清中可查到针对供者组织相容性的抗原的特异性抗体，这种抗体能凝集供者的红细胞（在人，则对供者的淋巴细胞有细胞毒作用）。

上述实验结果无可辩驳地证明：移植排斥反应是一种特异性免疫反应。

图10-4　第一次排斥反应及第二次排斥反应

（三）移植抗原（组织相容性抗原）

移植的异体组织之所以被排斥，是因为受者的免疫系统对供者的组织发生了免疫反应的结果。引起这种免疫反应的抗原称为移植抗原（Transplantation　Antigens）或组织相容性抗原（Histocompatibctity　Antigens）。在小鼠，这一抗原系统称为H-2抗原系统，一个H-2抗原分分由二个具有H-2特异性的肽和二分子β2微球蛋白构成。小鼠H-2抗原的分布密度以脾脏为最高，其次为肝、淋巴结、胸腺；再次，以肺、肾上腺、肾脏之顺序递减，红细胞、脑、睾丸、骨骼肌很少。

组织相容性（Histocompatibility）表示一动物种系各个成员的抗原个体性（Antigenic　Individuatity），它决定于有核细胞表面的组织相容性抗原（移植抗原）的个体性。各种动物的主要组织相容性抗原都是由专门的基因决定的。决定主要组织相容的基因区称为主要组织相容性基因复合体（Majon　Histocompatibility　Complex,简称MHC）。小鼠的MHC座落在第17对常染色体短臂外端1/3，包括四个亚区。据估计，H-2基因复合体所含基因多达500余个，每一个区约含50～60个基因。H-2基因复合体的功能一是决定存在于细胞表面的同种异体抗原合成，另一是调控免疫反应（包括免疫反应及免疫抑制），二者之间是有关联的。因为很多免疫学特性是细胞膜功能的反应。

近交系和杂系小鼠异体移植的成败一般决定于下述规律：（参看表10-8和图10-5）

表10-8　接受组织移植的规律

供　体	受　体	接受或排斥
近交系（同性别）	同一近交系	接受
近交系	其它近交系	排斥
近交系	本近交系与另一近交系交配生产的杂交一代（F1）	接受
近交系？？？	同一近交系？	接受
近交系？？	同一近交系？	排斥
杂交一代	杂交一代的亲本近交系	排斥
杂交二代	杂交一代	接受
杂交一代	杂交二代	排斥（少数接受）

图10-5　不同近交系小鼠及其杂交一代之间的移植结果

⑴同一近交系的两个个体AA与AA（或BB与BB）之间进行器官移植时，移植物能够存活。

⑵不同近交系AA与BB之间进行移植时总是不成功。

⑶AA与BB的杂交第一代系F1（AB）与亲代之间进行移植时，如果AA→F1（AB）或BB→F1（AB），则因为供者有F1所含有的抗原成分，所以可以成功，但是，如果反过来，F1（AB）→AA或F1（AB）→BB，则不成功（图10-5）。

⑷F1（AB）之间进行交配所产生的F2，以及F3、F4……Fn，与F1（AB）之间进行器官移植时，可以成功。

⑸F1（AB）之间进行交配所产生的F2的基因型比例是AA：AB：BB=1：2：1。将F1（AB）与AA或BB进行回交时，其产生的下代基因型为AB：AA（或AA：BB）=1：1。将AA的皮肤移植给F2时，假定决定主要组织相容性抗原的基因位点只有一个，则F2中有3/4，回交子代中有1/2能接受AA的组织移植而不排斥。如果二个基因位点相同，则F2中有（3/4）2，回交子代中有（1/2）2能接受AA供者的组织而不排斥。如相同的基因位点为n个，则F₂接受AA移植物机率为（3/4）n，回交子代为（1/2）n。在小鼠，n=4～13(根据实验得出的)。这一事实意味着：在进行同种移植时，即使一定数目的组织相容性位点相同，而其它的位点不相同也有一定的成功机率。

当然，人类在遗传学上是复杂的，所以不能把上述法则推之于人类，不过，除了一卵孪生子以外，不能根据（5）得出移植必然失败的结论。如果部分组织相容性抗原相同的话，用免疫抑制药还有可能使异体移植获得成功。

（四）骨髓移植

骨髓组织中含有免疫活性的淋巴干细胞及淋巴细胞，所以，如果将异基因型的骨髓移植给免疫机能低下（包括原发和继发）的受者，则将对受者（宿主）的组织发生免疫排斥反应，结果引起GVH反应（Graft　Versus　Host　Reaction,GVHR）；如果给受者移植不含有免疫活性细胞的组织，则受者供者组织将发生通常所见到的那种免疫排斥反应，即宿主抗移植物反应（Host　Versus　Graft　Restion,HVGR）。

在动物实验中可以造成GVH反应，它可以表现为矮小病（Runt　disease）或消耗病（Wasting　Disease）。矮小病是给初生动物（免疫功能还不够成熟）注射同种异系成年动物（免疫功能发育成熟）的脾细胞（相当一部分是下淋巴细胞），淋巴结细胞或胸腺细胞后而出现的，这时输入的T细胞与受者的移植抗原发生反应，结果，引起动物的发育不良。消耗病又称同种病（Homologous　Disease），它可以通过先给成年动物进行X线全身照射以造成免疫机能低下的状态，然后输入同种异体的淋巴细胞而造成，此时动物出现营养不良、贫血、消瘦、恶病质，最后死亡。

图10-6　大鼠的GVH反应产生矮小病的模式图

第二节　单克隆抗体研究中实验动物的选择与应用

一、单克隆抗体技术与实验动物关系

杂交瘤（Hybidoma）合成单克隆抗体（Monoclonal　Antibodies,McAb）是近年来生物医学中的一项重大突破。从根本上解决了免疫学中长期存在的“特异性”和“重复性”问题，在短短的几年里，在许多不同科学领域内发挥了巨大作用。

单克隆抗体技术是在1975年由Kohler和Milstein首创的，他们在60年代发展起来的细胞杂交技术的基础上，成功地把两种细胞融合在一起，一种是已适应体外培养的小鼠骨髓瘤细胞（都来自BALB/C品系的小鼠）和一种经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞融合，形成杂交细胞，发现这种融合的杂交细胞兼有两个亲代细胞的特征，即既有骨髓瘤细胞无限生长的能力，又有浆细胞合成单一抗体的能力。因此，这种免疫细胞通过克隆化，成为单克隆系（单一纯化的无性繁殖细胞系），就能产生大量单一类型的高纯度抗体，这种抗体就叫作“单克隆抗体”，如果把杂交细胞再种入动物体内，可形成“杂交细胞瘤”，瘤子产生大量抗体，就可以从动物体液中抽出含有单克隆抗体的体液，把这种杂交细胞在体外培养，培养液中就有大量的单克隆抗体，可供实验研究和临床研究使用。

目前，杂交瘤单克隆护体的应用范围愈来愈广泛，已经深入到整个生物医学的各个领域，诸如生物化学、分子生物学、免疫学、药理学、病毒学、细菌学、寄生虫学、肿瘤学、遗传学、药物学、血液病学、内分泌学等等。几乎所有抗原物质都可以应用这项技术获得针对单一抗原决定簇单克隆抗体。所以，可以说它是一把分子刀，用它可以剖析任何一种抗原物质的细微结构；它又是一种均质的、高特异性的抗体，可用它研究免疫学、遗传学、肿瘤学和其他学科中各种复杂的现象，同时还可用于诊断各种疾病，包括恶性肿瘤；它又可当作一种药剂治疗某些疾病，甚至肿瘤；还可以用于提纯各种蛋白质。

实验动物在杂交瘤单克隆抗体技术中占有极为重要的作用。它是形成单克隆抗体的必须条件。正如Milstein指出：如果在理论上没有克隆选择学说，在技术上没有细胞融合（Cell　Fusion）和培养方法，在材料上没有实验性骨髓瘤和体外培养的髓瘤细胞，就不可能出现单克隆抗体。这充分说明了实验动物和骨髓瘤细胞系在杂交瘤技术中的重要作用。

二、常用于淋巴细胞杂交瘤技术的实验动物

（一）小鼠BALB/C系

它是此技术中最常用的动物。目前用于细胞融合的小鼠骨髓瘤细胞几乎都来源于BALB/C系小鼠。其杂交瘤可接种于BALB/C或它的杂交第1代小鼠，从带瘤动物取血清或腹水制备单克隆抗体。

BALB/C系小鼠起源于Bagg从1913年开始维持的白化株（Albine　stock）小鼠，Dowell从1923年开始作近交系培育，至1932年达26代，之后Snell将BALB加C即BALB/C，以前的近交历史不清，继之以Andervont为主，使BALB/C广泛传播和应用。1973年美国NIH增培育到近交157代。毛色基因为AA、bb、cc(白色)。H-2为d型。亚系有：BALB/cCd,BALB/cJ,BALB/cAnN等。该品系小鼠的主要特性：

1．免疫学特性：易患慢性肺炎。多数个体于6月龄以后出现免疫球蛋白过多症。主要是IgG1和IgA量的增加。免疫球蛋白的绝对量依饲养条件而异。腹腔注射矿物油后可引起浆细胞瘤。发生率0-60%，依亚系及饲养条件而异。较难诱发免疫耐受性。

2．生理学特性：血压较高。网状内皮系统器官与体重之比较大。大部分雄鼠在20日龄出现脾脏淀粉样性变。对放射线极度敏感。

3．癌发生率：乳腺癌发生率低（3%），但对致癌因子敏感。肾上腺和肺常发生，雌鼠的肺癌发生率为21%，网状细胞瘤为8%，血管瘤为6%，淋巴肉瘤为4.5%。

4．老化及寿命：老龄鼠出现心脏病和多发性动脉硬化症。平均寿命雄鼠为569～648天，雌鼠561～816天。252日龄平均体重为雄鼠30克雌鼠28克。

5．对细菌及病毒反应：该品系小鼠对鼠伤寒沙门氏菌C′5敏感，对麻疹病毒中度敏感。

6．饲养注意点：生育年龄长（至12月龄），容易饲养繁殖，最适稍高温度。为26-27℃因为体型较细，除了日常饲料外，每日早晚每只各喂1克白面包，每星期喂二次木鱼（日本传统加工食品），稍肥后较易繁殖，根据我们的饲养经验每周加三次煮熟的鸡蛋，效果很为满意。该品系小鼠易患肺炎，最好不要和其它近交系小鼠同室饲养，不使其它近交系小鼠发病的环境病原菌易使BALB/C鼠患鼠。

（二）大鼠LOU（又称LOU/Wsl）系

该品系可能来自Wistar大鼠，是1956年开始近亲交配而形成的品系。约在一岁龄时，大鼠回盲部淋巴结产生一种自发性肿瘤，发展迅速，当触及肿瘤后的一个月内死亡。此种肿瘤的发生率超过10%，形态为极低分化为淋巴细胞，称之为大鼠回盲部免疫细胞瘤（Rat　Ileocecal　Immunoocytoma），此种肿瘤移植于同系大鼠或其杂交第1代均易发生。

此种肿瘤约有60%病例合成单克隆性IgG或IgA，或K型Bence-Jones蛋白。未发现产生IgM。大鼠Y3-Ag1.2.3骨髓瘤细胞系是LOU系大鼠骨髓瘤体外培养所慕名而获，故LOU系大鼠也适用于B细胞杂交瘤技术。

LOU/C大鼠8月龄以上的雄鼠自发性浆细胞瘤发生率为30%，而雌鼠为16%，常发生在回肠淋巴结，其中60%的这种浆细胞瘤合成单克隆免疫球蛋白IgG1(35%)、IgE(36%)或IgA。LOU/C与LOU/M的组织相溶性相同，可以互相接种进行皮肤移植。

双特异性单克隆抗体（BSMCA）的研究，是项国剑桥大学分子生物学实验室Milstein博士（单克隆抗体技术创始人之一）正在进行的研究，国际上刚开始，制备双特异性单克隆抗体就必须要使用LOU大鼠。同时，用LOU大鼠制备单克隆抗体其腹水产量比用BALB/C小鼠大几十倍，能较好地解决单克隆抗体的大量制备。双特异性单克隆抗体技术和杂交～杂瘤技术是单克隆抗体技术的新进展，BSMCA可代替交联剂，代替酶标技术，在免疫组化和免疫测定技术有广泛的应用价值，在癌症的导向治疗和体外免疫扫描诊断上有广阔的应用前景。

三、实验动物的自发性和诱发性骨髓瘤

（一）自发性骨髓瘤

根据报导能合成免疫球蛋白的肿瘤存在于狗、马、地鼠、大鼠和小鼠。除大鼠、小鼠外，这类肿瘤在其它动物仅偶然发现，故未能广泛用于研究。在小鼠中，与Ig产生相关联的肿瘤包括浆细胞瘤（骨髓瘤）和淋巴瘤。这些肿瘤能分泌Ig或有Ig结合在在细胞表面，或分泌与表面结合同时存在。至今研究最广泛的、能产生Ig的小鼠肿瘤为浆细胞瘤。其来源为单克隆性，几乎每一种浆细胞瘤细胞都只产生一种Ig分子，含有相同的轻链和重链。小鼠自发性浆细胞瘤最常发生于回盲部粘膜固有层，伴有粘膜溃疡和粘膜下炎症。晚期肿瘤转移至肠系膜淋巴结。Pilgrim系统研究了125例小鼠回盲部浆细胞瘤，诊断依据是在回首部有形态异常的浆细胞。此种肿瘤一般难以移植成功。据报导，已建成的移植性瘤株有：产生IgG的×5563，产生IgA的×5647、SPCI和DPCI（均来源于C3H/He小鼠）及YPCI（来源于BALB/CXA的F1杂交小鼠）。

（二）诱发性骨髓瘤

1959年Mervin首先报导BALB/C小鼠诱发性浆细胞瘤是将装有C3H小鼠乳腺癌组织的微孔扩散盒植入小鼠腹腔，6个月后在腹膜下结蹄组织的发生浆细胞瘤或纤维肉瘤并有出血性腹水。后来发现，BALB/C小鼠腹腔注入Freund　佐剂可诱发浆细胞瘤，只注射矿物油也可诱发浆细胞瘤。1962年Potter报导，小鼠腹腔注入矿物油0.5毫升，两个月1次，共3次，40～60%雌鼠可诱发浆细胞瘤。其诱发可能与多种因素有关，最重要的是遗传因素。BALB/C小鼠有独特的敏感性，浆细胞瘤诱发率很高，其它纯系小鼠如DBA/2、A/He、A/LN、C57BL/He、C57BL/Ka、C3H/He等，注射矿物油或植入扩散盒仅偶见诱发浆细胞瘤。NZB小鼠可能和BALB/C系小鼠一样敏感，但由于动物死于其它原因，诱发率通常较低。BALB/C与其它品系小鼠杂交的第1代，注射矿物油的诱发率一般很低，但例外的是（BALB/C×NZB）F1的诱发率高达60%。另一有关因素是激素，BALB/C小鼠注射矿物油时，雄性鼠诱发率比雌鼠高。雌鼠注射睾丸酮可提高诱发率，注射孕酮、雌二醇、皮质醇则可抑制浆细胞瘤发生。注射纯的链烷化合物Pristane（2，6，10，14-四甲基十五烷）可以在BALB/C小鼠诱发浆细胞瘤。1983年Potter报导，浆细胞瘤的诱发率大致和注射Pristane的量成正比，注射总量为1.5毫升（分三次注射，每次0.5毫升）的诱发率为61%；剂时1毫升（一次注射）的诱发率为42%，1毫升分两次注射的诱发率为39%；一次注射0.5毫升的诱发率仅为22%。鼠龄对诱发率也有影响，比较2个月、8个月和1年龄的动物，其诱发率以1年鼠龄动物最低。

四、用于融合的动物骨髓细胞系

淋巴细胞杂交瘤（Lymphocytic　Hybridoma）技术需要骨髓细胞系（Myeloma　Cell　Line）。在淋巴细胞融合技术中，理想的骨髓瘤细胞系应能获得高融合率，并得到产生特异性抗体的杂交瘤。有些骨髓瘤细胞系不仅融合率不高，而且本身分泌免疫球蛋白（Ig），致使杂交瘤细胞仍分泌亲系骨髓瘤的Ig链。据估计，细胞融合时，在两种重链和两种轻链随机组合的情况下，得到的杂交瘤可能产生10种Ig分子，特异性抗体只占其总量的1/16。为了得到只分泌特异性抗体的杂交瘤，需选择本身不产生Ig的骨髓瘤细胞系。其次，适用的骨髓瘤细胞系应对8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine,8-AG）或6-硫鸟嘌呤（6-thioguanine,6-TG）有抗药性，缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthineguanine　Phosporibosyl　Transferase,HGPRT），不能利用外源性次黄嘌呤（H），在含HAT（次黄嘌呤Aypoxanthine，氨基蝶呤Aminopterin，胸腺嘧啶核苷Thymidine）的培育液中死亡。

现已建立的用于B细胞杂交瘤技术的小鼠和大鼠的骨髓细胞系有下列几种

（一）小鼠骨髓瘤细胞系

1．小鼠P3-NS1/1-Ag4-1(1976年kohler)。是常用的骨髓瘤细胞系，来源NS1/1是小鼠骨髓瘤P3（MOPC21）细胞系的亚系，P3细胞分泌IgG1(K)。NS1/1细胞不合成重链（rl），只合成而不分泌轻链（K）.P3-NS1/1-Ag4-1是NS1/1的亚系，抗8-Ag(20μg/ml)，在HAT培养液中死亡。

2．小鼠P3-X63-Ag8。是Kohler和Milstein首次获得产生McAb杂交瘤所用的骨髓瘤细胞系。来源：它来自BALB/c小鼠的P3（MOPC21）骨髓瘤细胞系，分泌IgG1(K),抗8-AG（20μg/ml），在HAT培养液中不生长。

3．小鼠P3-X63-Ag8.653(1979年Kearney)。是P3-X63-Ag8的亚克隆，不可逆地丧失表达免疫球蛋白rl重链和K轻链的能力，其生长特性、融合率及所产生的杂交瘤细胞系的稳定性等方面均可与PS-X63-Ag8或P3-NS1/1-Ag4-1相比拟。

4．小鼠P3-X63-Ag8-U1（1980年Sharon）。是P3-X63-Ag8骨髓瘤细胞系的变系。P3-X63-Ag8分泌重链（rl）和轻链（K），P3-NS1/1-Ag4-1则只合成而不分泌轻链（K）。

5．小鼠SP2/O-Ag14（1978年Shulman）。Kohler等将PS-X63-Ag8骨髓瘤细胞系与具有抗绵羊红细胞活性、产生r2b重链和K轻链的BALB/c小鼠脾细胞融合得到杂交瘤细胞系Sp2/HLGK，从后者得到的Sp2/HL-Ag进行再克隆，得到Sp2-Ag14。它抗8-AG，在HAT培养液中死亡，不分泌Ig链，其细胞含有约73个染色体，比P3-X63-Ag8骨髓瘤细胞系多8个染色体，用其融合得到的杂交瘤数与P3-X63-Ag8相似。

6．小鼠45.6TG1.7（1976年Margulies　）。来源于小鼠MPC-11骨髓瘤，分泌重链（r2b）和轻链（k），抗6-TG（5μg/ml）,在HAT培养液中死亡。

7．小鼠45.6TG1.7.5(1980年Sharon)。是45.6TG1.7骨髓瘤细胞系的亚系。

8．小鼠PuBul-Ou(1976年Kohler)。是分泌IgG2a（k）的骨髓瘤细胞系，对哇巴因（Ouabain）抗药。

（二）大鼠骨髓瘤细胞系

在细胞融合技术中，使用大鼠骨髓瘤细胞系的优点是，从带瘤大鼠得到的血清和腹水量约比小鼠高10倍，适于大量生产McAb或同种异型的抗大鼠抗体。

1．大鼠Y3-Ag1.2.3（1979年Galfre）。Lou系大鼠的骨髓瘤经体外培养获得的细胞系R210，从它得到抗8-AG的亚系210·RCr3.Agl（分泌k轻链），后者经两次克隆，选获Y3-Ag1.2.3。它经5个月连续培养后，与脾细胞的融合率可达到小鼠髓瘤细胞系的水平。在显微镜下，Y3-Ag1.2.3系及其杂交瘤细胞比小鼠P3-X63-Ag8骨髓瘤细胞要小的多。它在OMM培养液（含5%胎牛血清）生长良好，在软琼脂易产生克隆。Y3-Ag1.2.3及其杂交瘤所产生的克隆，细胞分布较分散，不象小鼠×小鼠杂交瘤的克隆细胞密集。用它与DA系大鼠脾细胞融合，获得抗小鼠IgG的大鼠McAb。其杂交瘤YAZ/4OH（LK）细胞接种在（LOU×DA）F1大鼠可以产生肿瘤，带瘤大鼠血清中抗体含量为10～15mg/ml。因此认为210.RCY3-Ag1.2.3是适用于大鼠×大鼠细胞融合的骨髓瘤细胞系。

2．大鼠YB2/o（1982和Kilmaruin）。此细胞系不分泌k轻链。将YB2/o及Y3-Ag1.2.3分别与经酵母微管蛋白免疫的大鼠脾细胞融合，结果证明两者均适用作细胞融合的亲系，而且YB2/O产生的杂交瘤不分泌骨髓瘤的抗体链。接种杂交瘤的大鼠血清滴度可达1：106。

第三节　肿瘤学研究中实验动物的选择和应用

一、肿瘤学研究中的实验动物的作用

肿瘤（Tumor,Neplasm），尤其是恶性肿瘤（癌症或癌瘤，Cancer）是目前危害人类生命健康最严重的疾病之一。据统计，现在全世界大约每年有千分之一的人生癌症，有五百万人左右死于恶性肿瘤，在不少国，肿瘤的死亡率仅次于心血管病而占第二位。在我国，肿瘤也是一大类常见病、多发病，据近年来在约六亿人口范围内的死因调查统计结果推算，全国新患恶性肿瘤的人每年在一百万左右，死亡八十万人左右。因此，应该承认，肿瘤是医学上的一个“老大难”问题。

研究肿瘤的病因学、发病学、肿瘤细胞的生物学特性、肿瘤和宿主的相互关系、肿瘤的诊断预防和治疗等等有关肿瘤的一切知识的总体称为肿瘤学（Oncology或Cancerology）。概括言之，可以把它分为两大领域：临床肿瘤学和实验肿瘤学，前者以人为主要对象，主要目的是预防和诊治这一疾病；后者的对象较广泛，主要以实验室手段探索与肿瘤有关的各方面课题，以其各项成果为前者服务。在实验肿瘤学研究中，实验动物是其主要研究对象和材料。可以说实验肿瘤学研究者一天离不开实验动物和实验动物科学的各项开发研究成果。通过选用实验动物进行动物实验，创立了实验肿瘤学，发现了化学致癌物质和致癌病毒，推动了肿瘤学的研究，为肿瘤的防治开辟了广阔的前景。特别是近交系动物的发展，对肿瘤的病因学、发病学、实验治疗和新抗癌药物的研究等都发挥了重要作用。

二、实验动物的肿瘤学特点

（一）不同种属动物

1．灵长类动物：从种系发生上看，非人灵长类实验动物与人类的亲缘关系最近，它们也会发生各种形态上和生物学性质上与人的肿瘤相似的病变。已知，它们的肿瘤发病率与动物的种属、性别、年龄及捕养的时间有关。在实验室条件下，猕猴的自发性肿瘤发病率较高。在动物园内，猕猴的肿瘤发生率约为1%。在老年灵长类动物中，以上皮性肿瘤和恶性淋巴瘤为最常见，脑肿瘤则少见。常用中子或质子射线照射加以引发，可以获得猕猴的颗粒细胞性白血病。据报导，猫猴和狨猴也会发生淋巴细胞性白血病。原生灵长目动物肿瘤性疾患的敏感性。特别是对化学致癌物的敏感性，较之类人猿种属为高。

2．大型实验动物：这里包括家畜。这些动物肿瘤发病率随种属而异，例如雌犬常发生乳腺肿瘤，母牛则否。但雌犬所发生的此种乳腺肿瘤与人乳腺癌的表现不同。前者是混合型的，不仅包括上皮性成分，还包含有骨和软骨等组织。猪常发生肾母细胞瘤，家犬、家猫、马、羊、牛等则否。马倾向于发生阴茎癌，羊和牛则会发生肝癌。家犬、马和牛的黑色素瘤较之家猫、羊和猪为多见。Hereford种牛则会生眼结膜的上皮细胞癌。

3．小型实验用哺乳动物：这里主要指啮齿类实验动物。首先强调在实验肿瘤学研究中使用小鼠的Slye氏(1922)指出：小鼠的肿瘤，无论在组织发生上、临床过程上以及组织形态学上都与人类肿瘤有相似之处。后来，由Little氏等培育出近交系小鼠后，在实验肿瘤研究中广泛应用各种高癌和低癌品系小鼠进行研究。

大鼠也广泛地应用于肿瘤研究的许多领域之中。它的体形较大，供给的组织较多，便于进行手术、注射等实验操作。但是，它们的自发性肿瘤的总的发病率过远较小鼠为低。例如，大鼠通过肝癌颇为少见。然而，大鼠的肝脏对于致癌剂的作用却是很敏感的，已通过大鼠肝癌的研究积累了大量有关肝癌病因学、发病学和分子生物学方面的资料。再如，大鼠的白血病的发病率也低，而且白血病发病大鼠多数颗粒细胞型的，而小鼠的白血病以淋巴细胞型为多见。

金黄地鼠在下列各方面常被用于抗癌研究之中：如研究致癌的脱氧核糖酸病毒，利用其颊囊移植肿瘤等。

豚鼠曾被认为是很少发生肿瘤的实验小动物。但是，近年来的研究发现，它们也会自发多种肿瘤，根据Dawe氏等（1973年）列举的数字得知，已经观察到的豚鼠肿瘤也有29种之多。其中，以支气管乳头状腺瘤和白血瘤为最多见。后一肿瘤还曾经被连续移植传代成功。投用脲酯后也曾引发豚鼠肿瘤。三年龄以下的豚鼠发生的肿瘤易于转移，但幼年豚鼠其肿瘤的发病率不高。

4．鸟类：这一类实验动物所发生的肿瘤以其病毒病因引人注目，特别是造血系统和间叶组织的肿瘤其病毒病因已较明确。鸡群中所发生的由疱疹类病毒引致的Marek氏病引起的肿瘤学者的很大兴趣。因为，它作为一个实验模型，可与人类的Burkitt氏淋巴瘤、猴的淋巴瘤、蛙的Lucke氏肾癌等相类比。

鸡和其它鸟类对肿瘤病毒的研究具有极高的实用价值。为此，日本目前大力开发鸡的SPF化，除去已知的白血病病毒（必要时除去马来克氏病毒，即把SPF鸡在乙烯基隔离器连续2代饲养，使鸡确实达到SPF化）；研究它们对白血病、肉瘤病毒等毒株的感受性，和抗清对马来克氏病毒受性的遗传；研究解决有关内源性病毒的遗传性控制；开展品系内可移植实验的近交品系和有关鹌鹑、鸭子、野鸡等鸟类的SPF化。

5．两栖类实验动物：蛙所发生的Lucke氏肾腺癌是研究较多的肿瘤。它是由至少四种病毒所引起的。这一类实验动物在细胞和体液免疫方面具有一些特征。因此，为了研究免疫抑制状态在肿瘤（如淋巴网状系统肿瘤）发生中的作用，使用两栖类动物是有用的。另外，两栖类动物的无毛而光滑的皮肤为皮肤肿瘤的姓和发展的研究提供了有用的。另外，两栖类动物的毛而光滑的皮肤为皮肤肿瘤的发生和发展的研究提供了一个与人的情况更为接近的实验模型基础。

6．鱼类：除了软骨鱼类，其它种属的鱼自发性肿瘤并不少见。鱼类肿瘤的病毒病因并不重要，但是已经发现鱼群肿瘤的发生具有区域性和流行，说明可能有某种传染病因在起作用。鱼类，作为一种实验动物，对化学致癌物颇为敏感，例如黄曲霉素或二甲基亚硝胺可引发鱼（尤以鳟鱼）的肝脏肿瘤和肾母细胞瘤。因此，鱼是测试环境致癌因素的敏感对象。北方狗鱼的淋巴瘤也被视为研究人的相应肿瘤的用模型。通过鱼种间杂交而形成的杂种就能自发地和大量地反应肿瘤，如将中美洲的两种热带鱼——剑尾鱼（Xiphophorus　Helleri）与阔尾鱼（Platypoecillus　Maculatus）进行杂交或进一步将其杂交第一代（F1-hybrid）与剑尾鱼回交，就可以产生自发黑色素瘤的带瘤杂种。

（二）不同类型的实验动物

1．近交系实验动物：应用这一类型实验动物的肿瘤研究者，主要着眼于实验动物肿瘤方面的遗传性状。不同近交品系动物的有着不同的遗传性状，其自发瘤发生率有明显的不同，对同一致癌物质的敏感性也往往不同。因此，为了不同的肿瘤研究需要，可以选用在肿瘤学上具有不同的遗传性状特点的近交系动物进行研究。

近交系动物的自发瘤的发生率高低不等，有一些高癌系小鼠，只要活到一定的年龄，无需任何外加的处理，几乎可以100%地自然发生白血病、肺癌或乳腺癌等恶性肿瘤，从而证明了癌症是可以遗传的。同样，也可以通过遗传学的方法培育出对致癌因此敏感性高或低的动物品系来，说明诱发肿瘤的发生相当程度上也取决于动物的遗传组成。这些高癌品系的动物是肿瘤学研究的有用工具。例如，C3H近交系小鼠是一种乳腺癌高发的品系，其体内有一种乳腺癌病毒即乳汁因子，可以通过授乳而传给子代，CH3雌鼠在乳汁因子和激素（多次妊娠）的作用下极易发生乳腺肿瘤；而C57黑色小鼠是极少患乳腺肿瘤的低癌系小鼠，乳汁因子在其体内甚至不能生存繁殖，因此即使乳汁因子去感染它也不能致癌。如果用C57黑雄×C3H雌鼠杂交的方法，把C57黑的基因引扩C3H雌鼠的杂交后代中，也能使后者体内原有的乳汁因子趋于死灭。用病毒、射线或激素都很容易使C3H小鼠发生乳腺肿瘤。近年来也发现Snell氏近交系小鼠易患肺腺癌，而C57黑小鼠易患肺心血管疫病，如使这些小鼠长期吸入纸烟的烟，则在前者肺腺癌发生率高且出现很早，而在后者仅小肺血管病变比对照组增多，但未能诱发出肺癌。这说明相同的外因作用于不同基因型小鼠时，产生了完全不同的结果。

由于不同近交品系动物的遗传性状各不相，研究者可以选择其不同的品系特点进行各种肿瘤学研究，例如为了研究遗传因素在某种肿瘤（如乳腺癌）发病中的作用，需要选用高（乳腺）癌系小鼠，并与低（乳腺）癌系小鼠进行对比。为了获得某种病毒引发的肿瘤，就要选用对这一病毒具有敏感性的近交品系动物。为检定某种可疑致癌物的作用，常要选用中等肿瘤发病率的近交系动物（如SWR系小鼠）。在某些快速检定的情况下，也要选用高肿瘤发病率的近交品系动物（如A系小鼠,Sprague-Dawley系大鼠）。

在实验肿瘤学研究的各个领域中，只要以实验动物为对象，绝大多数以使用近交系动物为宜。这样做，便于实验设计，使动物实验结果准确、均一、经济、有可能重复再现等。实验肿瘤学研究中使用得最多的是近交系小鼠和大鼠。选用任何一个品系动物时，应先熟悉该品动物在肿瘤以及其它方面的性状特征，以利实验设计、结果分析和总结。在有关肿瘤遗传学、肿瘤移植术、肿瘤免疫学以及化学致癌研究的工作中，特别要注意各品系实验动物的遗传性状方面的特征。

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有用的疫病模型（Pollard,1973年）。GF大鼠和小鼠所发生的恶性肿瘤几乎全部发生在内分泌系统或受激素作用的组织。这可能是由于GF和CV在内分泌系统的功能活动上有差别的缘故（Nomura氏等1973年，Einarsson氏等1974年）。无菌动物几乎不发生内分泌系统和造血系统以外性恶性肿瘤。这充分说明，存在着环境致癌因子的作用，而采用系统的无菌技术可以除去这些因子，形成一个防护屏障，使有机个体不受这些因子的危害。

癌的病毒病因学说，可以应用无菌动物进行研究而予以检验。在化学引癌过程中，实验动物体内的菌群能影响致癌过程。此种影响包括：产生或破坏致癌物，干扰机体对致癌物的解毒功能，改变致癌物质的分子结构从而影响它们被机体吸收的过程以及加快肠道的排空速度而影响致癌物的吸收等等。人的结肠癌的发生与环境因素密切相关。因此，肠道菌群与进入肠道的环境中物质的关系值得研究。已知：口服苏铁素，对GF大鼠无致癌性，而CV大鼠对这一物质的反应则相反。CV大鼠肠道中的菌群能将这一物质转移为致癌物，从而引起结肠的和其他类型的癌（Spatz氏等1965年）。

3．无胸腺裸体小鼠和大鼠：裸鼠已在肿瘤移植术、癌的病因学、癌的实验治疗学、癌的免疫学、癌病毒学以及化学致癌研究等实验肿瘤学研究的许多领域得到了应用。

裸鼠是一种独特的纯系动物。例如裸小鼠，就其基因型而言，它们带有?

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人体肿瘤数百种，这些瘤株除了能防止由传代而伴随的肿瘤组织形成学退化外，还能保持原代细胞的各种功能，如胃癌细胞产生的粘液、恶性黑色素瘤细胞产生的黑色素、肝癌细胞产生的甲胎球蛋白等，同时在多种情况下还可显示各种肿瘤所产生的激素，加上其对治疗实验、化疗及放疗的敏感性和临床结果的一致性，使这些瘤株成为研究抗癌药物一个较为理想的工具，1983年Bodgen等用无胸腺小鼠肾囊膜内移植人体肿瘤法筛选新药，全部实验仅11天，且成功率较高。

三、动物肿瘤模型的选择

如上已述，不同种属、品系和类型的实验动物其肿瘤学方面的性状各不相同，肿瘤学研究工作应当熟悉实验动物科学的开发研究成果，对有关的资料有比较全面的了解，才能为自己的课题选到合适的实验动物肿瘤模型。

实验动物的肿瘤模型可以概括地区分为下面四类：

（一）自发性肿瘤模型

实验动物种群中不经有意识的人工实验处置而自然发生的一类肿瘤称之为自发性肿瘤。自发性肿瘤发生的类型和发病率可随实验动物的种属、品系及类型的不同而各有差异。肿瘤实验研究中，一般应当选用高发病率的实验动物肿瘤模型作为研究对象，否则就无法进行研究。当然，低发病率的肿瘤模型也有一定用处，可以用它作为对照。

肿瘤实验研究中选用自发性肿瘤型为对象进行研究有一定优点：首先是自发性肿瘤通常比用实验方法诱发的肿瘤与人类所患的肿瘤更为相似，有利于将动物实验结果推用到人：其次是这一类肿瘤发生的条件比较自然，有可能通过细致观察和统计分析而发现原来没有发现的环境的或其它的致癌因素，可以着重观察遗传因素在肿瘤发生上的作用。但应用自发性肿瘤模型也存在一些缺点：肿瘤的发生情况可能参差不齐，不可能在短时间内获得大量肿瘤学材料，观察时间可能较长，实验耗费较大。

某个近交品系动物在一定年龄内，可以发生一定比率的某种自发性肿瘤。目前已培育了许多种小鼠自发肿瘤，从肿瘤发生学上看，这些自发瘤与人体肿瘤相似，进行肿瘤发病学和药物筛选等实验应属理想。但由于不易同时获得大批病程相似的自发瘤动物，又因这种肿瘤生长较慢，实验周期相对较长，所以一般很少用于筛药。近年有人应用AKR自发白血病小鼠进行化研究，该小鼠出生后一年半内有高于90%的发病率，曾作为研究人体白血病和淋巴瘤的模型，它对药物的治疗反应类似儿童急性淋巴性白血病。由于病程较长，已用于综合化疗研究药物诱导缓解和维持缓解的最适治疗方案。此肿瘤可用强的松和长春新碱诱导缓解，也可以环磷酰胺和甲基-CCNU诱导缓解，再用阿糖胞苷维持缓解，后者疗效最好。自发肿瘤多数为病毒性，如C3H小鼠出生后有高的乳腺癌发生率，A系小鼠出生扣18个月内有90%的肺癌发生率，AK和C57小鼠有高的白血病发生率等等，这些肿瘤多发生于体表部位或易为目前体检新发现的部位。AKR白血病的生长规律研究提示，该鼠出生时即带有致癌的RNA病毒，于鼠龄6～13月内，每月小鼠自发瘤的死亡率为15～20%，而伴有增殖能力的瘤细胞常于诊断前一个月在小鼠胸腺中出现，诊断后中等生存期为16天，以上规律的阐明为化疗提供了基础知识。当前新药研究中自发瘤模型应用最多的小鼠自发乳癌，常用高自发率的C3H小鼠或BALB/C雌鼠与DBA/2雄鼠杂交的第一代CD2F_１小鼠（自发乳癌），它们于生后10个半月可摸到肿瘤，而后生存20～35天死亡，大量繁殖此类小鼠，自发瘤可高达70%。一般于摸到肿瘤块后分组给药，观察其平均生存时间的延长率来评价药物的疗效。

（二）诱发性肿瘤模型

用化学致癌物、射线或病毒均可在各类动物中诱发不同类型的肿瘤。强化学致癌物二甲基苯蒽（DMBA）和甲基胆蒽可诱发乳癌，二苯苄芘诱发纤维肉瘤均已列为美国NCI第二筛瘤株。现举DMBA诱发大鼠乳腺癌试验为例，取鼠龄2月的Sprague-Dawley雄鼠，单次灌喂麻油溶解DMBA20mg，肿瘤自60天开始生长，至120天癌发生率达63～100%。此时开始分组给药,并每周测瘤大小及记录死亡时间作为疗效指标。还可用DMBA诱发乳头状瘤，实验用丙酮溶解DMBA150ug/小鼠，隔14天二侧背部皮肤各涂一处，第3周用巴豆油0.5mg，在同一部位每周涂2次共3～4月。当瘤>4mm开始治疗，每天腹注或口服一次，共5次，每周一次共2～6周，用测量瘤大小办法来观察抑制率。用二乙基硝胺（DEN）0.005%掺入饮水中口服8个月诱发大鼠肝癌。此外15PPb黄曲霉素AFB，或0.06%奶油黄连续口服4个月均可诱发大鼠肝癌。于诱发期肿瘤形成之前观察药物的抗致癌作用。用于化疗研究的还有α-萘腰等诱发田鼠和狗的胱膀癌，N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）诱发大鼠胃癌，此外用1%DEN皮下注射，每天50mg/Kg，连续3周再观察半年内小鼠肺癌发生率也可达94%。食管癌和鼻咽癌等也用致癌物诱发成功，部分也已用于药物作用的研究。但致癌的诱癌过程需时较长，成功率多数达不到100%，肿瘤发生的潜伏期个体变异较大，不易同时获得病程或癌块大小较均一的动物供实验治疗之用，再加之肿瘤细胞的形态学特征常是多种多样，且致癌多瘤病毒常诱发多部位肿瘤，故不常用于药物筛选，但从病因学角度分析，它与人体肿瘤较为近似，故此模型常用于特定的深入研究。由于该类型肿瘤生长较慢，瘤细胞增殖比率低，倍增时间长，更类似于人肿瘤细胞动力学特征，常用于综合化疗或肿瘤预防方面的研究。

在使用化学致癌致癌时，要注意各类化学致癌剂对动物致癌的特点，如芳香胺及偶氮染料类致癌物的特点是①通常需要长期、大量给药才能致癌；②肿瘤多发生于远隔作用部位的器官如膀胱、肝等；③有明显的种属差异（见表10-9）；④其本身不是直接致癌物，致癌是由于其某种代谢产物的作用；⑤其致癌作用往往受营养或激素的影响，例如，奶黄仅在以缺少蛋白质和核黄素的饲料喂饲大鼠时才引起肝癌，而且雄性大鼠较敏感，邻位氨基偶氮甲苯则易起雌性大鼠的肝癌。

表10-9　不同种类动物对口服芳香胺类致癌物的敏感性比较

动　物	2-萘胺	4-氨基联苯	联　苯　胺
人	膀　胱	膀　胱	膀　胱
狗	膀　胱	膀　胱	膀　胱
猴	膀　胱	-	-
地　鼠	膀　胱	-	肝
小　鼠	膀　胱	肝	肝
大　鼠	无	乳腺、肠	外耳道、肠
家　兔	无	膀　胱	膀　胱

亚硝胺类的致癌特点是：①致癌性强，小剂量一次给药即可致癌；②对多种动物（包括猴、豚鼠等不易诱发肿瘤的动物）的许多器官（包括食管、脑、鼻窦等不易引起癌的器官）能致癌，甚至可以通过胎盘致癌，如给怀孕大鼠以二乙基亚硝胺（Diethy　lnitrosamine,DEN）可比较快地引起仔鼠的神经胶质细胞瘤；③具有不同结构的亚硝胺有明显的器官亲和性，例如二甲基亚硝胺等对称的衍生物常引起肝癌，不对称的亚硝胺如甲基苄基亚硝胺常诱发食管癌；在大鼠，二丁基亚硝胺能引起膀胱癌，二戊基亚硝胺能诱发肺癌，而N-甲基-N-硝基-N１-亚硝基胍则能引起胃肠癌。

黄曲霉毒素的毒性很强，很小剂量（1mg/kg体重）即可使狗、幼龄大鼠、火鸡或小鸭致死；其致癌性也极强，最小致癌剂量比亚硝胺还要小数十倍，是已知化学致癌物中作用最强者。它能诱发多种动物（从鱼到猴）的肝癌，也可引起肾、胃及结肠的腺癌，滴入气管内可引起肺鳞状细胞癌；注入皮下可引起局部的肉瘤，还有报告认为，它可引起泪腺、乳腺、卵巢等其它部位的肿瘤。

在动物实验中早已确定：乙硫氨酸可诱发大鼠肝癌；乌拉坦（氨基甲酸乙酯，C_２H_５O－CONH_２）、氨乙胺可引起小鼠的肺癌；一些卤代烃如四氯化碳、氯仿等可引起大鼠或小鼠的肝癌。

（三）移植性肿瘤模型

目前肿瘤化疗所应用的大多数药物，都经动物移植性肿瘤试验而被发现，因此它是筛选抗肿瘤新药中最常用的模型。其优点是接种一定量瘤细胞或无细胞滤液（病毒性肿瘤）后，可以使一群动物带有同样的肿瘤，生长速率较一致，个体差异较小，接种存活率近100%。地宿主的影响也类似，易于客观判断疗效，且可在同种或同品系动物中连续移植，长期保留供试验之用，试验周期一般均较短，因此当前抗癌药筛选中绝大多数用移植瘤试验，如各种体型实肿瘤，腹水瘤和白血病等均被广泛使用。但是这类肿瘤生长速度快，增殖比率高，体积倍增时间短，这些都是与人体肿瘤的显著不同点，特别是与人的实体瘤差别更大。许多国家筛选抗癌药物中选用移植瘤株经常改变，主要原因可能也与此有关。现在世界上保有近500种的动物移植瘤，但常用于筛药的不到40种，多数为小鼠肿瘤，其次是大鼠和仓鼠移植瘤，包括小鼠L₁₂₁₀淋巴白血病，艾氏腹水瘤，Friehd病毒白血病，肉瘤180，Lewis肺癌，腺癌755，白血病615，白血病P388，Walker-256，吉田肉瘤，肉瘤45，Liol淋巴瘤，Dunning　白血病，白血病L5170Y，P1534淋巴白血病，P1798淋巴肉瘤，LPC-1浆细胞瘤，淋巴瘤8，Gardner淋巴肉瘤，B16或Cloadman黑色素瘤，Ridaway骨肉瘤，肉瘤37，P315白血病，Ｗagner癌肉瘤，Mur　hy-sturm淋巴肉瘤，Jensen肉瘤，Geurin氏癌，仓鼠十二指肠腺癌和人体肉瘤HSL第1代杂交鼠移植。它们对抗癌药作用的敏感性大致可分为敏感，中度敏感，低敏感和不敏感瘤株四类，敏感瘤株多数生长迅速，瘤细胞增殖比率高，倍增时间短，如L₁₂₁₀、P388、W256，吉田肉瘤，Wagner瘤和肉瘤45。中度敏感的有艾氏腹水瘤和实体瘤，肉瘤180，肉瘤37，格氏癌。低敏感瘤有大鼠肉瘤M₁和AkR自发白血病。不敏感肿瘤多生长缓慢，瘤细胞增殖比率低，如小鼠皮肤癌，CH3自发乳腺癌和诱发癌。同样敏感株对抗癌药的疗效水平也不相同。

（四）人体肿瘤的异种移植性肿瘤模型

将人体肿瘤移植于免疫缺陷动物，因能保持其生物学性，用于研究人体肿瘤对药物的敏感性有较大的帮助，当前日益受到多方面的重视。早期工作是将人体肿瘤移植于动物缺乏免疫防御机能的特殊部位，如鸡胚，动物的眼前房，地鼠颊囊内，虽有一定比例的存活率，但因肿瘤生长缓慢又受植入部位包膜的限制，往往肿块生长较小，难以传代，更不能适应需要较多瘤源的实验治疗工重，近些年来将人体肿瘤移植于免疫缺陷动物或无毛无胸腺小鼠（裸鼠），取得了较大的进展，故美国国立癌症研究所（NCI）于1977年已提出包括人体肿瘤移植于裸鼠的二筛实验模型。人工制造免疫缺陷动物用于异种移植的研究，是先将动物胸腺切除，后给900拉德大剂量照射，照后2小时输注骨髓或再给抗淋巴细胞血清，进行异种移植才能生长。由于异种移植需要附加因子，不同于它们生长在人体的自然条件下，对药物的反应性可能也不同。但由于具有病情类似人体的优点，近年来实验报导日益增多。

1966年以来发现和培育了一种无毛裸小鼠突变株，可能直接作为人体肿瘤异种移植的接受体，不需进行附加因子的处理，可使人体肿瘤移植后生长良好。肿瘤细胞形态、染色体含量和同功酶水平与人体肿瘤一样，说明未发生细胞选择和细胞杂交现象，细胞动力学和生物化学特征也未变，故这种小鼠的异种移植人体肿瘤已成为免疫学和肿瘤学研究中较为理想的模型，用于实验治疗方面的研究报导也明显增加。随着对裸鼠生殖生理及生长特点知识积累，目前对如何提高供应量已制订出一套饲养、繁殖和管理办法。目前已成功把将结肠癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、黑色素癌、胃癌、淋巴瘤和白血病、肾病、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠，获得一定百分比（37.5%）的良好生长肿瘤部分并可传代。若用已建株的人体肿瘤组织培养细胞作移植材料，接种后成活率更高（41%）。这些成活的肿瘤对化疗药物的敏感性与临床所见十分相近。黑色素瘤以DTIC和CCNU的抑瘤作用较强，而5-Fu则无效，与其临床客观疗效三药分别为20%，12%及2.5%的结果相似。人Burkitt淋巴瘤的祼鼠移植后对环磷酰胺有较高的敏感性，也与临床结果相符，其他肿瘤如乳腺癌和结肠癌裸鼠移植，对前者阿霉素（5-mg/kg）、5-Fu（50～80mg/kg）和苯丙氨酸氮界（7mg/kg）均有一定的抑瘤效能，对后者甲基－CCNU和丝裂霉素也有明显疗效。有趣的是对P388无效的六甲密腰，而对人体肺癌异种移植有效，应用其耐受剂量60～90mg/kg都有消瘤作用，对人体乳癌MX-1和结肠CX-1也有效。此药重新临床试用，证明对人支气管肺癌和淋巴瘤确有治疗作用。最近对过去因毒性较大而中断研究的偶氮氧代正亮氨酸，重新用人肿瘤裸鼠模型评价，证明对MX-1和肺癌XL-1有明显疗效，又重新进入临床研究。近有人用胸腺嘧啶核苷444～888mg/kg给肿瘤裸鼠连续灌注90～140小时，发现它能明显抑制人体黑色素瘤及畸胎瘤的生长，并导致肿瘤消退而对宿主无明显毒性，这些新结果已引起临床重视。

近来将人癌组织移植入裸鼠肾囊膜内，观察肿瘤生长大小，在双目显微镜下测量肿瘤直径OMU，比较给药组和对照组的差异，在11天左右可以得到药物疗效的结果。此方法比皮下接种快速，新近用正常小鼠代替裸鼠进行类似试验，在6天或更短的时间内也可获得有价值的资料，因为6天内免疫机能还不可能发挥作用。这样可以节省繁育裸鼠的工作量，有较大的实际意义。

四、近交系小鼠和大鼠中自发性肿瘤的发病率

（一）近交系小鼠

1．自发性乳腺肿瘤

（1）A系小鼠：生育雌鼠高，未生育者低。繁殖雌鼠群发病率为80～84%，良成雌鼠中5～30%。A/He乳系小鼠（繁殖雌鼠）中40%；A/J中25%。

（2）C3H系小鼠：繁殖雌鼠几乎为100%。C3H/B；85～90%；C3H/HeJ80～100%，C3H/HeN繁殖鼠和处雌鼠中接近100%。C3H/Bi生产雌鼠85～90%。

（3）DBA系小鼠：DBA/1经产母鼠61.5～75%。DBA/250～60%。

（4）DD系小鼠：生产雌鼠63%，7.7月龄生产雌鼠84%。

（5）FM系小鼠：生产雌鼠90%以上。

（6）PBA系小鼠：35周龄生产雌鼠75%。

（7）RⅢ系小鼠：生产雌鼠88%。RⅢ/An育成雌鼠49%。

CC57BR、CC57W、TM、TSI、IF、C57BL等品系小鼠中基本没有乳腺癌或不发生自发性乳腺肿瘤。BALB/C雌鼠3%，但投给乳癌因子后升高。C57BL/6J生产雌鼠1%。C57BL/CdJ、C57L、L、MAS/A、NZO、XLⅡ小鼠自发乳腺癌低。

2．自发性肺脏肿瘤

（1）A系：达18月龄小鼠发病率为90%。A/J发病率高，雄鼠40%，雌鼠30%。

（2）SWR系：达18月龄小鼠80%。

（3）PBA系：12月龄生产雌鼠77%。

（4）中等发病率品系：BALB/C雌鼠26%，雄鼠25%；CC57BR为25；CC57W24.5%；RF37%；XVⅡ♀为19.5%；BL约26%。

（5）低发病率的品系：DBA/13.8%；XLⅡ；（CBA×C3HK）F1雄鼠0%（C3H×C3HK）F1雄鼠5.6%。

3．自发性肝脏肿瘤

（1）C3H系：C3H/Hc达14月龄雄鼠为85%；C3Hf达14月龄雄鼠为72%；C3HcB/De达14月龄的雄鼠为78%，育种雄鼠为90%，未生育雌鼠为59%，生育雌鼠为30%，多产雌鼠为38%；C3HvB/Fe64%。

（2）CBA系：CBA/J雄鼠65%；（CBA×C3HK）K142.9%。

（3）中等发病率品系：CE发病率高：（C3H×C3HK）F1雄鼠25%；C57BR/cdJ雄鼠25%；VY12～14月龄雄鼠13～24%。

（4）低发病率品系：C3H/Bi雄鼠10%，雄鼠不发生；C3H/Fg雄鼠8%；YS12～16月龄雄鼠3～11%；（A×C57BL/10）F11.4～2.4%；（LP×C57BL/10）F12.1～7.2%；（BA×C57BL/10）F13.5～7.5%；（LP×129）F15.2～7.4%；（LP×DBA/2）F12.3～9.

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（1）SJL系：育成雄鼠91%，生产雌鼠发生率高；SJL/J13.5月龄生产雌鼠88%，12.5月龄雄鼠91%；SJL/N一年以上的小鼠中有类何杰金氏病的多形细胞性网织细胞肉瘤，为Wanedo网织细胞肉瘤的宿主。

（2）RF系：发病率为56.2%。

（3）FB/Ki亚系：约50%。

（4）C57L系：达18月龄时，Hodgkin氏病样病变，网织细胞瘤（B型），近25%。

（5）BALB/C系：发病率低，8%。

7．自发性卵巢瘤

（1）RⅢ系：17月龄生产雌鼠60%，育成雌鼠50%。

（2）C3H系：C3HeB/Fe19月龄生产雌鼠64%，育成雌鼠22%；H3HeB/De24.3月龄末生育雌鼠47%，21.5月龄生育雌鼠为37%，多产者为29%。

（3）CE系：雌鼠33%。

（4）RF系：发病率低，4.4%。

8．自发性胃肠道肿瘤

（1）Ⅰ系：胃肿瘤自发率达100%。

（2）BRS：有自发性胃肿瘤现象，或于注入甲基坦蒽后发生。

（3）发病率低的品系：（LP×129）F1雄鼠0%，雌鼠2.6%；（LP×DBA/2）F1雄鼠2.4%，雌鼠4.7%；（129×DBA/2）F1雄鼠4.3%，雌鼠1.7%；（LP×C57BL/10）F1雌鼠2.1%。

（4）NZO系：十二指肠肿瘤雌鼠20%，雄鼠15%。

9．自发性垂体瘤

⑴C57L系：老年生育雌鼠33%。

⑵C57BR/cd：老年生育雌鼠33%。

⑶C57BL系：求偶素作用后，几乎达100%。

10．自发性肾上腺质皮瘤

⑴CE系：自发率高，6月龄后雄鼠性腺切除100％，7月龄后雌鼠性腺切除79%。

⑵NH系：自发的腺瘤发病率高，去势后癌发生率高。10%的老年小鼠有肾上腺节结性增生及腺瘤，6周龄时做性腺切除可提高腺瘤发生率。

11．自发性先天性睾丸畸形瘤

⑴TER/SV亚系：自发率达30%。

⑵129系：1%（先天性）；129/RrJ5%。

12．自发性周身肿瘤

（LP×129）F1雄鼠259%，雌鼠31.2%(LP×DBA/2)F1雄鼠42.9%，雌鼠67.4%；（129×DBA）F1雄鼠44.7%，雌鼠37.9%；（CBA×C57BL/10）F1雄鼠15%，雌鼠44.5%；（A×C57BL/10）F1雄鼠45.2%，雌鼠61.2%；(CBA×C3HK)F1雄鼠52.4%；（C3H×C3HK）F1雄鼠38.9%；(LP×C57BL/10)F1雄鼠45.2%,雌鼠47.9%。

13．其他自发性肿瘤

血管内皮瘤：HR系有19～33%的自发率，经致癌剂处理后，发病率升高为54～76%。

皮肤乳头状瘤：HR/De22月龄无毛小鼠9％。

骨髓上皮瘤：A和BALB/C自发率4%。

（二）近交系大鼠

1．ACI系：雄鼠自发性肿瘤：睾丸46%，肾上腺16%，脑垂体5%，皮肤和耳道以及其它类型6%。雌鼠自发性肿瘤：脑垂体21%，子宫13%，乳腺11%，肾上腺和其它类型6%。

2．ACH系：自发性回肠肠系膜淋巴瘤发生率高。

3．A7322：自发性乳腺癌发性率高。

4．BN系：雌鼠上皮瘤28%，雄鼠2%，输尿管肿瘤雌鼠20%，雄鼠6%。雄鼠大部分肿瘤是膀胱癌35%、胰腺腺癌15%、脑垂体腺瘤14%、淋巴网状组织肉瘤14%、肾上腺皮质腺瘤12%、髓质性甲状腺癌9%、肾上腺嗜铬细胞瘤8％。雌鼠：脑垂体腺瘤26%、输尿管瘤22%，肾上腺皮质腺癌19%、子宫颈肉瘤15%、乳腺纤维性腺瘤11%、胰腺腺瘤11%子宫颈和阴道肿瘤已有较详研究。

5．BUF系：老年动物中自发性脑垂体瘤30%、肾上腺皮质瘤25%。两年龄大鼠中有自发性甲状腺癌。

6．COP系：能产生自发性胸腺肿瘤。

7．DONRYU系：yoshida肿瘤和腹水肝肿瘤有100%发生率。

8．F344系：雌鼠乳腺癌41%，脑垂体腺瘤36%，多发性子宫内膜肿瘤21%，乳腺纤维腺瘤9％。雄鼠乳腺癌23%。脑垂体腺癌24%，睾丸间质细胞瘤86％，单核细胞白血病24％。

9．LOU/C系：大于8月龄的雄鼠自发性浆细胞瘤的发生率大约为30%，而雌鼠为16%，可用作高发性浆细胞瘤的研究。其肿瘤发展迅速，常发生在回肠淋巴结。

10．M520系：小于18月龄动物的子宫、脑垂体前叶、肾上腺髓质和皮质以及间质细胞瘤的发生率在0～10%范围内，但大于18月龄的12～50%雌鼠有子宫瘤，35%育成雄鼠有间质细胞瘤，60～85%动物表现出肾上腺髓质瘤，20～45%为皮质瘤，20～40%有脑垂体前叶瘤。

11．NIR/Gd系：在大于一年龄动物中，右心房或下腔静脉（心房腔静脉上皮间质瘤）的发生率约为20%。

12．OM系：自发性甲状腺癌为33%。大于18月龄动物的肾上腺皮质瘤为94%，18月龄的脑垂体瘤为8～18％，乳腺癌为26～30％，大于10月龄动物的视网膜退化症发生率高。

13．WAB系：大于二年龄的大鼠良性胸腺瘤的发生率为23％，睾丸摘除的雄鼠发生率为50%，切除卵巢的雌鼠发生率为75%。

14．WAG系：甲状腺髓质癌27%，嗜铬细胞瘤2%，胰岛细胞瘤15。老年雌鼠腺瘤的发生率为69%，其它常见肿瘤有甲状遥髓质癌40%，肾上腺皮质腺瘤29％，乳腺纤维腺瘤21％，在290只动物中发现19种其它类型的肿瘤。

15．WF系：雄鼠结肠癌发生率38．1％,雌鼠结肠癌发生率27.6%，脑垂体肿瘤27%，乳腺癌21%，肾上腺肿瘤3%，恶性淋巴瘤7%，脂肪瘤3%。

16．WN系：自发性恶性和乳腺瘤发生率为30～50%。在任何年龄的动物体内都未见子宫瘤和间质细胞瘤。小于18月龄动物的脑垂体前叶肿瘤为0～35%，肾上腺皮质和髓质肿瘤0～10%，大于18月龄动物的脑垂体肿瘤为40～93%，肾上腺皮质和髓质肿瘤发生率为25～50%。发现有鳞状细胞组织变性和甲状腺增生。

17．肿瘤研究中其它几种常用大鼠品系及其所发生的肿瘤类型：Wistar系的分泌促乳激素的垂体肿瘤和白血病；Spragur-Dawlcy系的自发性乳腺肿瘤，X-线引发的乳腺肿瘤；Osborne-Mendel系的乳腺肿瘤，肾上腺皮质肿瘤，卵巢肿瘤Mars-hall520系的肾上腺髓质肿瘤。

第四节　放射生物学研究中实验动物的选择和应用

一、实验动物在放射生物学研究中的作用

进行放射生物学研究是实验医学中最复杂的任务之一。因为在放射生物学实验研究中，不仅要求工作人员遵守相应的措施，免受超允许剂量的照射或沾染，而且还要得到能客观反应辐射与生物对象互相作用真实情况的稳定结果。这就必须同时满足许多条件，其中最重的条件之一，就是要选择适于研究课题需要的动物种类、建立实验模型。

超过一定剂量的高能辐射作用于机体，可引起体一系列全身性综合病症，称为放射病，或称为急性放射综合症（Acute　Radiation　Syndrome）。这种病在平时极少见到，只有在核战争和核事帮情况下才可见到该病。因此研究这种疾病眩要是在实验室内选择各种实验动物来进行研究的。今天我们对辐射损伤的大部分知识，不是来自方广岛或长畸，也不是来自几个出过事故的反应堆，大量的知识是通过选用各种实验动物进行动物实验积累起来的。关于辐射的远期遗传效应至今只有动物实验的材料。

由于在实验室可以随时选择各种实验动物并使其接受不同剂量的照射，可以复制成病变相似、病例多量的不同类型的放射病或辐射损伤，这就为放射生物学研究提供了极为便利的条件，对放射医学的发展起到了极大的推动作用。

二、实验动物对辐射效应的影响

同样种类和剂量的辐射以相同的方式作用于机体时，所出现的后果往往用动物的种类、年龄、性别、机体状况等而异，即有不同的辐射反应。放射生物学研究中常用放射敏感性（Radiosensitivity）的概念来观察个体组织、细胞的敏感程度。放射敏感性，是指当一切照射条件完全严格一致时，机体或其组织成部分在射线作用下发生的某种变化的程度和速度，若变化大且其发生迅速，则表明其敏感性高，反之，则相反。一般文献资料中多以细胞、组织的形态学损伤或机体的死亡作为判断放射敏感性的依据。下面所指的放射敏感性，都是以此为准的。

（一）种系发生过程中的放射敏感性

不同种系动物的放射敏感差别很大，总的趋势是：种系发生的等级愈高，机体结构愈复杂，其放射敏感性也愈高。脊椎动物的放射敏感性高于无脊椎动物；在脊椎动物中，哺乳类比鸟类、鱼类、两栖类和爬虫类为高。哺乳类中各种实验动物的放射敏感性差异也较大，豚鼠、狗、山羊、和绵羊、猪对射线比较敏感，猴、小鼠次之，大鼠、田鼠更次之（见表10-10）。

表10-10　各种动物羊致死剂量比较表

动物种类	LD50/30		动物种类	LD50/30
	伦琴	拉德		伦琴	拉德
猴	500～550	546	豚　鼠	200～400	400
羊	350～500	237	田　鼠	700	-
猪	230～275	247	大　鼠	600～800	796
狗	250～300	244	小　鼠	400～600	633
兔	750～800	751	人	285±25	-

家兔对放射的敏感性与其它实验动物有一定差异。家兔的LD50/30的剂量为750～800伦琴或751拉德，但其受射线照射时初期反应比其它动物要敏感得多，常出现一种应激反应性的变化，我们称之为放射性休克状态，而且随着照射剂量的不断增加，休克的发生率也随之增加，如不及时采取抢救措施（当动物发生四肢软瘫并不断抽搐，瞳孔尚未散大之前，立即由于耳缘静脉快速注射25%可拉明0.5～1.0毫升，同时配合作人工呼吸），丧失抢救时机，动物会很快死去，对实验影响很大。家兔照射初期的放射性休克发生率与照射剂量呈一定的线性关系（见表10-11）。

表10-11　家兔*照射初期休克发生率与照射剂量关系

（剂量率24.5伦琴/分）

照射剂量（伦琴）	休克发生率%
600	16
700	22
800	27
900	33
1000	39
1100	45
1200	51
1300	57
1400	63
1500	69
1600	75

*杂种兔照射初期休克发生率要低

同一种动物中的不同品系亦可表现出显著不同的放射敏感性。例如BALB/cAnN小鼠对X线或r线照射均极为敏感。A系小鼠对X线照射高度敏感。LACA小鼠对射线也较敏感。而C57BR/cdJN对射线不敏感，而具有一定、抗射线的能力。Wistar大鼠在一定剂量范围内，对两种射线的敏感性应高于杂种大鼠。

（二）个体发生中的放射敏感性

哺乳动物在个体发育的不同阶段，其放射敏感性有明显的差别。一般规律是放射敏感性随着个体发生的过程而逐渐降低。在胚胎植入前母体受照射时，放射敏感性很高，较小的剂量即可引起胚胎的大量死亡；此时不死的胚胎可继续发育，畸形发生率较低。在器官形成期进行照射时，虽胚胎的死亡率降低，却出现较多的畸形和死胎。有人认为，这一时期是胚胎发育过程中放射敏感性很高的“危险期”。在器官形成期的后期，胚胎的放射敏感性开始下降，胎儿期的放射敏感性明显地低于以前各期（图10-7）。

图10-7　胚胎发育不同时期的辐射敏感性

（小鼠200R照射的实验资料，并外推引伸到人体）

在出生后的个体发育过程中，幼年动物的放射敏感性比成年的要高，但老年动物的机体由于各种功能的衰退，其耐受辐射（特别是大剂量辐射）的能力低于成年时期。

（三）组织和细胞的辐射敏感性

动物不同组织和细胞对辐射作用的反应有很大的差别。成年动物机体各种细胞的放射敏感性与其功能状态有密切的关系。早在1906年Bergonie和Tribndeau在观察大鼠睾丸的辐射效应时就曾发现，分裂的细胞（生精细胞）受辐射的影响较不分裂的细胞（间质细胞）要大。根据这些观察，他们提出了一条定律，即有丝分裂活动旺盛、正常时进行许多次分裂的细胞以及在形态结构和功能上未分化的细胞对射线敏感。即一种组织的放射敏感性与其细胞的分裂活动成正比，而与其分化程度成反比。他们提出的这一定律已被其后许多其它的观察所证实，基本上是符合于客观实际的。按照细胞动力学特点，可将体内的主要细胞组织分为下表中的三在类（表10-12）。表中左侧的组织对辐射很不敏感，右侧的组织则对辐射非常敏感。中间的各种组织则介手其间。

表10-12　细胞动力学特点不同的各种组织

无有丝分裂 无细胞更新	分裂指数低 细胞更新少	有丝分裂频繁 细胞更新较快
中枢神经系统	肝	表　皮
感觉器官	甲状腺	小肠上皮
肾上腺髓质	血管内皮	骨　髓
	结缔组织	生殖腺

动物各种组织中，有一类组织是依靠细胞的分裂不断进行更新的，称为“增殖性组织”。造血组织，胃肠道上皮组织，生殖腺，皮肤上皮（包括毛囊上皮）组织都是增殖性组织。另一种组织在器官发育完全之后，细胞不再更新，如中枢神经系统，心脏，骨骼骨等。还有一种组织在发育成熟后继续进行缓慢的分裂，当受伤后可加速细胞更新的，如肝、肾及结缔组织。各种组织对射线的敏感性与细胞分化程度、细胞增殖能力、代谢状态以及细胞的周期环境有密切关系。一般说，分化程度低的、细胞分裂活跃的、代谢旺盛的（细胞DNA合成旺盛）组织对放射敏感性高，否则相反。根据这些特点进一步对动物各组织的放射敏感性进行了分类，其排列顺序为：

1．高度敏感组织

⑴淋巴组织（淋巴细胞和幼稚的淋巴细胞）；

⑵胸腺（胸腺细胞）；

⑶骨髓组织（幼稚的红、粒和巨核细胞）；

⑷胃肠上皮，尤其是小肠隐窝上皮细胞；

⑸性腺（睾丸和卵巢的性细胞）；

⑹胚胎细胞。

2．中度敏感组织

⑴感觉器官（角膜、晶状体、结膜）；

⑵内皮细胞（主要是血管、血窦和淋巴管内皮细胞）；

⑶皮肤上皮（包括毛囊上皮细胞）；

⑷唾液腺；

⑸肾、肝、肺组织的上皮细胞；

3．轻度敏感组织

⑴中枢神经系统；

⑵内分泌腺（除性腺外）；

⑶心脏；

4．不敏感组织

⑴肌肉组织；

⑵软内和骨组织；

⑶结缔组织

三、放射生物学研究中实验动物的选择

（一）实验动物种系的选择

放射生物学研究中可选用成年的猴、猪、羊、狗、兔、豚鼠、田鼠、大鼠、小鼠等动物来作实验。我们认为用猴、狗、大鼠和小鼠复制放射病模型比较理想。BALB/cAnN、A、LACA小鼠和Wistar大鼠对射线敏感，应该首选。

（二）实验动物性别、年龄、体重的选择

关于动物性别对放射感染性影响的报导是有争论的。一些材料证明雌性敏感性较高。而另一些（占多数）材料则认为雄性敏感性高或性别间无明显差别。性别间无明显差别在狗的实验中得到很好的证明。然而，在性周期的不同阶段，雌性动物的放射敏感性可能有变化。考虑到这点以及在实验中可能混入妊娠的雌性动物，所以在绝大多数情况下为放射生物学实验选择动物时，应该优先选用雄性动物。

因为动物的体重和年龄增加，可降低放射生物效应。这一点在照射狗时表现得更为明显。深入研究表明，当改变照射的几何位置时，在死亡率、放射性综合征的严重程度方面，仍程度不等地存在着这种影响（表10-13）。

表10-13　400伦丙种射线单向和多向照射对不同体重狗^＊损伤作用的综合材料（AkoeB1971）

体　重	死亡率（%）	平均寿命（天）	平均严重程度（相对单位）
			初期反应	出血综合症	放射病
多向照射
小	100	16.2	1.70	3.00	3.15
中	60	13.2	1.50	3.00	3.05
大	80	13.6	1.10	2.50	2.90
单向照射
小	40	17.0	1.60	3.00	2.55
中	20	16.5	1.20	2.80	2.30
大	20	16.9	0.90	2.40	2.10

*小体重：7.0～11.0公斤，中等体重15.5～22.7公斤，大体重24.0～29.5公斤。

实验证明两kg以上家兔比两kg以下的放射敏感性低，大鼠的体重由180g增加到350g可以引起放射生物效应的降低。当照射小鼠时未见辐射效应与体重之间有密切的关系。因此注射生物学实验所用的动物体重，小鼠18～22g，大鼠180～220g，豚鼠250～300g，家兔2～2.5g，狗10～15kg。对慢性实验，考虑到实验的持续时间长，可选择体较小的动物。希望实验所用的各组动物的体重波动在一定范围内，小鼠1～2g、小鼠5～10g、豚鼠15～20g、家兔200～300g。体重的波动范围可以容许在±5～7%。

（三）实验动物辐射损伤病变特点的选择

在相类似的情况下，不同种系动物的放射病明显程度和发生时间是不同的。小鼠和大鼠几乎完全没有全身初期反应，豚鼠表现的不大显著，而狗和猴则非常明显。在家兔常常可观察到对照射所特有的休克样反应，并有部分动物在照射后立即或不久死亡。

小鼠和大鼠造血系统的损伤出现得最早（表10-14）。豚鼠、狗和猪造血障碍的特点发展比较缓慢。猴的造血改变与豚鼠、狗和猪相同。

肠放射综合征在小鼠和大鼠中表现得非常明显（表10-15），而家兔、豚鼠、狗和猴则明显。

表10-14　各种动物急性放射病时的造血障碍

（CeMeHOB　1965）

动物种类	照射剂量（伦）	表现最明显的时间
		白细胞减少	贫血	骨髓空虚	淋巴样组织再生障碍
小鼠	400	4	12	4	2～4
	700	4	12	4	3
大鼠	500	4	12	4.5	1～5
	700	4	12	4	3
豚鼠	500	8	12	-	4
	700	7～8	12	6	4
狗	600	7～8	-	7	5～6
猪	400～600	5	-	7	-
猴	550～700	7	-	-	-
	500～6500	10以后	-	-	-
	500～700	8～10	15	16	5～6

表10-15　各种哺乳动物急性放射病肠型阶段发展特点（CeMeHOB）

动物 种类	致死剂量（LD100）650～1100伦		超致死剂量（2000～7000伦）
	肠型死亡时间（天）	肠型阶段死亡数(%)	肠型死亡时间（天）	肠型阶段死亡数（%）
小鼠	3～4	40	3～4	100
大鼠	3～4	30	3～4	100
狗	5～7	0	3～4	100
豚鼠	5～7	10	5～7	100
猴	-	0	6～7	100

表10-16　各种动物急性放射病时某些感染并发症的发生率（%）

（CeMeHOB）

动物种类	照射剂量（伦）	扁桃体坏死性炎症	齿龈炎	肺　炎	肠　炎	结肠炎
小鼠	700	0	0	20	20	0
大鼠	500～700	0	0	10～20	10～30	0
豚鼠	500～700	0	0	40	5	3
狗	500～700	75～83.3	11～44.9	61	8	28
猴	500～700	-	1～9.8	15.2～16	16.6～40.7	35

急性放射病并发的感染过程在不同种类的动物中各有特点（表10-16）。小鼠和大鼠的特点是发生肺炎和肠炎。狗的典型感染并发症是坏死性咽峡炎和齿龈炎以及发生率较高的肺炎和发生率较低的结肠炎。小鼠、大鼠和豚鼠感染的特点是具有播散的倾向，引起全身败血症，而狗和猴的感染过程具有局限性特点。

人的放射病就其表现而言，与豚鼠、狗和猴的病理变化相似，其中与豚鼠相差较远，而和猴最为接近。

（四）实验动物不同季节和昼夜过程辐射效应的选择

在其它条件相同的情况下，动物在不同季节和昼夜过程的辐射效应有一定差异。因此要求动物预先适应实验环境和考虑动物在不同季节和昼夜的活动规律。机体内环境功能和季节性和昼夜性波动通常称为生物节律。它们对生物效应的影响是由于机体的许多生理机能活动在一昼夜间和一年四季中发生极其明显的变化所致。现已知实验动物的体温、血糖、基础代谢率、内分泌腺激素的分泌等均会发生昼夜明显的变化。

实验证明，不同季节对辐射效应有影响。家兔的放射敏感性在春夏两季升高，秋冬两季降低。在狗的实验中，这方面的关系虽不象家兔表现得那样明显，但狗在春、夏两季照射后的死亡率比秋、冬为高。小鼠的放射敏感性，在冬季和初夏显著升高，而初春和夏季则降低。大鼠的放射敏感性则没有明显的季节性波动。

动物对照射的敏感性的昼夜间有不同的变化，这种变化见于不同性别、种系和年龄的小鼠和大鼠。白天放射敏感性降低（死亡较少，LD50/30较高，体重下降较少，肝脏损伤较轻），夜间升高。同时，在小鼠和大鼠实验中，除了夜间21～24点的高峰外，还发现白天（小鼠9～12点，大鼠15点）损伤加重的情况。下午和后半夜放射敏感染性最低。大鼠与小鼠不同，其放射敏感性虽有昼夜间的明显波动，但不很剧烈。因此，为了得到有可比性的实验结果，所有实验组动物应在同一时间内进行照射。

因为哺乳动物放射病的急性期于第30天前结束，所以对小动物照射后观察30天，对狗（如未较早死亡时）则观察45天。地慢性放射病实验动物的观察，建议不少于12个月。

（五）实验动物对辐射作用条件的选择

1．辐射种类

不同种类的辐射所产生的生物学效应不同，从射线物理特性来看，电离密度和穿透能力对其生物效应有重要影响。α射线的电离密度较大，但穿透能力很弱，因此，由外照射时，对机体损伤作用小，而发射α射线的核素进入体内时则对机体的损伤作用很大。β射线的电离能力较α射线的小，而穿透力较大，由外照射时可引起皮肤表层的损伤，由内照射时亦引起明显的生物效应。X射线和r射线穿透力很强，与体内物质作用时产生次极电子，后者引起电离效应，其电离密度α及β射线的小，但由于能穿透深层的组织，由外照射时易于引起严重损伤。一般实验室常选用⁶⁰Cor射线照射动物进行各辐射损伤研究。快中子和各种高能重粒子也都具很大的穿透力，而且在其射程的未端产生极高的电离密度。外照射时可引起比x和r射线更严重的损伤。

2．辐射剂量

辐射剂量与生物学效应之间存在着一定的相依关系。总的规律是剂量愈大，效应愈显著，但并不是一个直线关系。

急性放射病动物模型的复制方法，关键在于照射剂量的选择。根据实验目的和要求，选择好合适的照射剂量，以便复制程度适中的急性放射病。

现将常用的狗、大鼠、小鼠、家兔和猴的照射剂量与动物存活情况列于表10－17～表10－21供选择照射剂量时参考。

表10-17　狗所受剂量与动物存活情况

A表

照射剂量 （拉德）	剂量率 （拉德/分）	动物数	30天内		存活百分率 %	平均存活天数
			存活数	死亡数
250		78	33	45	42.3	16.7
265		198	52	146	26.3	14.5
275	70	340	74	266	21.8	15.5
300	33.4～36.2	29	1	28	3.4	15.0
380	20.4	8	0	8	0	14.4

B表

腹部中心剂量（拉德）	头部剂量（拉德）	平均存活天数（天）
1500	1390	3.7
1940	1430	3.6
4860	3570	3.5
6800	5000	2.1
8740	6430	2.3
11650	8570	1.54

表10-18　狗所受剂量和死亡动物存活时间的关系

剂量范围（拉德）	动物数	存活时间（天）	剂量范围（拉德）	动物数	存活时间（天）
13500～13000	8	0.99±0.71	982～829	12	5.67±2.13
10900	9	2.04±0.88	754～647	5	9.64±1.95
8260～7190	23	2.87±0.99	580～400	10	13.75±4.49
6880～5440	16	2.67±1.10	390～305	13	13.11±2.00
4890～3090	35	3.78±0.71	269～200	8	17.01±4.65
2980～2060	32	3.66±0.53	151～134	3	19.07±7.86
1760～1240	23	3.61±0.51

表10-19　大鼠照射剂量与动物存活情况

A表

照射剂量（拉德）	动物数	照后30天内		存活率%
		存活数	死亡数
450	21	20	1	95.2
600	13	5	8	38.5
700	47	8	39	17.0
750	53	3	50	5.7
765	1131	169	962	14.9

B表

照射剂量（拉德）	剂量率（拉德/分）	动物数	存活时间（小时）
1400	156.7	10	93.6
1800	156.7	10	91.2
2000	156.7	10	86.4
2200	156.7	10	81.6
2400	156.7	10	81.6
2600	156.7	10	79.2
2000	250.0	5	84.9
10000	250.0	5	90.5
15000	250.0	5	87.6
20000	250.0	5	16.9
30000	250.0	5	7.12

表10-20　家兔照射剂量与动物存活情况

照射剂量（伦琴）	30天动物死亡率%
590	26
690	40
800	50
880	62
980	70
1450	93

表10-21　小鼠照射剂量与动物存活情况

A表

照射剂量（拉德）	动物数	照后30天内		存活率%
		存活数	死亡数
680	30	6	24	20.0
750	27	4	23	14.8
780	85	6	79	7.1
810	20	0	20	0
780～830	150	1	149	0.67

B表

照射剂量（拉德）	动　物　数	存活时间（小时）
1000～1100	8	255
1200～1400	6	191
1600	4	178
1800	14	96
2000	24	96
2200	20	103
2400	20	101
2600	20	100
2800	10	95

注：剂量率：165.5～172拉德/分

3．剂量率

剂量率即单位时间内机体所接受的辐射剂量。在一般情况下，总辐射剂量相同时，剂量率愈大，生物效应愈显著，但有一定的限度。如r-射线剂量率为30伦/分时，小鼠的LD50/30为840伦，而当剂量率为3伦/分时，LD_50/30则需1200伦。

4．分次照射及时间间隔

当辐射的总剂量和剂量率相同时，分次给予辐射的效应要低于一次给予的效应，总的规律是分次愈多，各次间的时间间隔愈长，则效应愈弱。例如，475伦的辐射一次照射小白鼠。60天内引起39%的动物死亡；若将上述照射剂量分成4次照射，每次照射间隔一天，则死亡率下降到23%；若同样分成4次，但每次间隔4天，则60天内全部动物可以存活。这种现象的发生，显然与机体的代偿和修复功能有关。

表10-22　猕猴照射剂量与动物存活情况^＊

照射剂量（伦）	动物数	30天内死亡数	平均存活时间（小时）
300	12	1	-
400	5	1	538
500	22	9	359
575	6	2	287
600	9	5	-
650	6	4	355
700	23	21	-
725	6	6	302
800	8	8	-
850	4	4	331
900	10	10	-
1500	8	8	190
2000	8	8	150
2500	8	8	156
3500	8	8	143
5000	8	8	142
7500	5	5	138
10000	5	5	48
15000	5	5	13.6
25000	5	5	6.7
40000	5	5	3.9

※《昆明医学院资料选编》1979年第1期2～3页

5．照射部位和面积

同样质和量的辐射对动物不同部位作用的后果是不同的。腹部对照射的敏感性很高，盆腔、头、胸、四肢辐射敏感性依次下降。如600伦照射动物四肢引起的放射损伤很轻，而600伦照射头或腹部时则可有严重的病理变化。

在辐射总剂量、剂量率和照射部位都相同的条件下，照射面积愈大，则生物效应愈显著，全身照射的后果最严重，如照射狗的四肢可允许1000伦或更大剂量，而全身照射300伦就可使半数动物死亡，可致典型的造血型放射病。

6．照射方式

照射方式一般可分为外照射和内照射；若二者兼有，则称混合照射。在外照射中，单向和多向照射对生物效应有很大的影响。多向照射引起的死亡率较高。生存时间较短。例如，从4个或12个方向（四联或十二联X线照射装置照射狗时，绝对致死量为500伦；而单向照射时，则绝对致死量为800伦，其原因可能是多向照射时组织接受的辐射剂量比较均匀。因此，我们用于照射动物的钴源，是装有自动旋转装置的，这样照射的剂量均匀。

内照射是指放射性核素进入机体后，在其体内发射特有的辐射，作用于不同组织。其损伤效应受许多因素的影响，主要有放射性核素的物理化学特性、侵入途径、分布和排出特点、物理学和生物半衰期等。例如α放射体的生物学效应大于β和r放射体；由呼吸道侵入机体时，粒子大于1～2μ者多沉积于上呼吸道，小于0.5μ者多进入肺泡；如为可溶性化合物可迅速吸收入血，而难溶性化合物则多沉积于局部组织及相应的淋巴结，小量地、缓慢地转移至其它部位。

四、放射生物学研究中实验动物的应用

（一）急性放射综合征研究中的应用

实验动物是研究急性放射综合征的主要对象，常采用⁶⁰Cor-射线照射实验动物，使其接受不同剂量的照射，复制成各种不同类型的放射综合征或称放射病。再来研究它的发病特点、变化规律、发病机理、诊断和防治方法等。

当动物全身一次受到较大剂量照射后，可产生急性放射病。随着照射剂量增大，可以出现一些典型的综合征。文献上对放射病分型和制定标准等问题看法不尽一致。根据我们的资料，以狗为例，当受到200～700拉德照射后，动物所出现的综合征主要是以造血系统功能和结构的变化为主，一般称造血型放射病；2000～8000拉德照射后，动物出现的综合征除造血系统功能及结构有严重损伤外，消化系统（胃肠道特别是小肠）出现明显变化，引起消化系统改变为主的综合征，称肠（胃肠）型放射病38000～15000拉德照射后可出现以心血管系统症候为主的放射病，叫心血管型放射病。15000拉德以上照射后，动物主要出现一些以中枢神经系统（主要是脑）症候为主的综合征称为脑型放射病。各型放射病之间并不是截然分开的，中间可有过渡型，而且病变也是交错存在的。照射剂量在800～2000拉德之间，随动物机状况不同可产生造血型或肠型放射病。照射剂量在800～15000拉德之间，随动物情况不同的可产生心血管型或脑型放射病。动物种类不同造成各型放射病所需剂量亦不同。

根据我们对372条狗、500只大鼠、1000多只小鼠的实验资料分析，我们认为急性放射病类型的划分标准应综合考虑四个方面问题：即⑴照射剂量、剂量率；⑵临床症状；⑶死亡时间；⑷病理检查。综合起来判定属哪种类型的放射病。造血型放射病的动物，造血器官（骨髓、脾、淋巴结）发生明显的改变，而消化系统（胃、小肠、结肠）只出现轻微的可恢复的一些变化，临床上可出现一般放射病的典型分期（初期、假愈期、极期）。病程2～4周。中度以上造血型放射病动物死亡原因是发生了严重的出血和感染的结果。肠型放射病，除造血系统发生严重的病变外，突出的病变在肠道（主要是小肠），动物照射后即可出现频繁呕吐，初期及假愈期短暂或不明显，很快进入极期，呕吐更为顽固，狗可吐出胆汁（吐黄）。第一、二天可出现不典型的的柏油便，此后即可出现血水便。吐黄、血小便是肠型放射病的典型临床症候，而出血和感染可以不出现。狗在照射800～2000拉德（交叉剂量范围）时可出现轻微吐黄水和血水便。这是一种过渡型（既有极重度造血症状，又有肠型症状）。由于肠型放射病动物小肠粘膜损伤、脱落、隐窝受到严重破坏，失去增殖更新能力，绒毛?

■［此处缺少一些内容］■

急性放射病一般分为造血型、肠型和脑型三型，但是否存在心血管型，目前国内外学者尚有争议，我们通过对203条狗和367只大鼠不同水平超致死剂量⁶⁰Cor射线一次全身照射后的心管功能、形态和血浆酶活力等变化观察证实在肠型与脑型之间存在心血管型放射病。此型放射病的造型剂量狗为9000～15000拉德，大鼠为20000～25000拉德，其特点是照射剂量介于肠型和脑型之间；病程较脑型稍长；有明显的心衰、休克等病症；出现一系列心血管功能低下的变化如动脉血压迅速下降、心输出量和心脏血流量早期即有明显减少、循环代偿功能丧失、心电图有明显反映心肌炎和心肌除极和复极过程障碍的变化，反映心肌损伤的LDH_１显著升高；病理形态学上可见到心肌严重病变，如心肌炎细胞浸润、心肌纤维萎缩、变性、坏死、溶解等变化，而此时小脑皮层颗粒细胞基本正常或固缩的还不多，病变严重者固缩最多也不超过２５％。心血管型放射病动物模型的复制成功，不仅对我们充分认识心血管系统辐射损伤在放射病发生、发展过程中的作用和急性放射病的分型问题上具有一定理论意义，而且在强辐射核武器杀伤效应条件下，伤员的分类、防护和救治方面也有一定实际价值。

狗的三种类型急性放射病鉴别标准可见表10-23。动物四种类型放射病造型所需的选择剂量见表10-24。

（二）内照射效应研究中的应用

放射性核素引起动物急性损伤的病理主要为破坏过程，它与核素分布类型有关。全身均匀性分布的核素急性损伤基本与外照射相同，如¹²⁷Cs、^３H等。那些选择性分布的核素除有类似全身照射的损伤表现外，同时还出现重要器官的局部严重损伤改变，如表10-25所列举的几种主要放射性核素的急性损伤中，亲骨性核素⁹⁰Sr主要表现为造血组织的损伤，动物死于严重的出血和贫血；视网状内皮系统的核素，如²¹⁰Po、¹⁴⁴Ce、¹⁴⁷Pm，对造血组织、肝、脾的损伤都比较严重，使动物死于广泛的出血、感染与胃肠功能障碍；选择性分布于甲状腺的¹³¹I主要造成甲状腺组织严重损伤与功能低下；吸入难溶性²³⁹PuO₂主要沉积于肺，引起肺功能不全，导致心肺功能衰竭死亡，这些都是核素的辐射作用所引起局部严重损伤的结果。

表10-23　狗三种类型急性放射病临床及病理变化的主要点鉴别

临床症候和病理变化	造　血　型	肠　型		脑　型
临床症候：
恶心呕吐……	有、轻或无	频繁呕吐	呕吐
粪便…………	柏油便或常便	柏油便、血水便	早期可有少量血水便
出血症候……	轻或很明显	一般无	无
感染症候……	有、明显	无	无
血象…………	变化依期发展	变化急骤	急骤变化
衰竭、失水…	有、轻	明显、重	有衰竭
症候分期……	明显	不太明显	分期与造血型不同
病程…………	2～4周	3～4天	2～3天、数小时或数分
病理变化：
造血系统……	轻或明显改变	严重破坏		严重破坏
消化系统（胃肠）…………	轻微可复改变	严重破坏		严重破坏
小脑…………	无或仅一般变化	无或仅一般改变		颗粒细胞严重损伤

表10-24　常用动物四型放射病造型选择剂量（拉德）

动物种类	造血型	肠　型	心血管型	脑　型
狗	200～700	1800～8000	8500～15000	15000以上
猴	400～900	2000～10000	-	15000以上
大鼠	400～1000	2000～15000	20000～25000	30000以上
小鼠	300～1000	2000～15000	-	30000以上

引起急性损伤的剂量，因各种核素的辐射类型、能量、化学性质以及它在体内的有效半碱期等因素不同而异。例如²¹⁰Po与³H相比较，²¹⁰Po为α辐射体，能量大，与体内蛋白质的硫基结合紧，且选择性沉积于对辐射敏感的造血组织内，有效半减期较长，而³H是一种低能量的β辐射体，有效半减期短，在体内呈均匀性分布，因而²¹⁰Po的急性损伤剂量比³H的低千倍。

放射性核素对动物的慢性损伤有两种情况，即小量多次和一次内污染放射性核素对动物的持续性内照射。有人曾观察了小量多次给家兔注射⁸⁹Sr对造血功能的影响，在三年内，每日注射⁸⁹Sr2.68微居里/公斤，它的造血功能损伤大致分三期：第一期⁸⁹Sr作用初期（11～12月），造血器官的变化不稳定，表现为网织红细胞数、血小板数、白细胞总数波动大。第二期上述血液指标波动小，网织红细胞数稍有增加。第三期出现红白细胞数、淋巴细胞绝对数、网织红细胞数减少。此外，还表现机体免疫功能减低、早衰、部分动物死亡。表10～26列举了几种核素对动物内照射远期引起肿瘤的结果，分析结果可以看出：远期损伤的部位多为该核素的紧要器官；损伤的性质多为恶性肿瘤和血液病；引起损伤的剂量也因核素的理化性质和器官的敏感性因素不同而异，因为亲骨性的诸核素，引起狗骨肉瘤的剂量也有差别（表10-27）。²³⁹Pu、²²⁶Ra、²²⁸Th、⁹⁰Sr四种核素相比，以²²⁸Th的相对生物效应最大。近年来有人对²³⁹Pu致动物骨肉瘤效应的研究证实，最低致癌剂量为78拉德。

表10-26　几种放射性核素对动物远期损伤的剂量与特点

放射性核素	实验 动物	重要器官	最低致癌剂量 （拉德）	远期损伤效应
90Sr	狗	骨骼	4000	骨肉瘤、骨髓增生、白血病
137Cs	狗	全身	1000～1400	甲状腺瘤、卵巢瘤、乳房癌、膀胱癌、胆管癌、神经细胞瘤、椎骨网状细胞瘤、淋巴肉瘤
144Ce	狗	肺、肝、骨	4200 29000 4200 950	肺腺瘤 肝血管肉瘤、肝纤维瘤 椎骨骨肉瘤、上颚磷状细胞瘤 白血病
210Po	狗	肝 肾	100 530	肝癌 胃癌
226Ra	狗	骨骼	1.1微居里/公斤	骨肉瘤
238U（UO2）	狗	肺	空气中铀浓度为5毫克/米３，每周5天，持续5.6年后	肺癌
239PuO2 239Pu(NO3)4	狗	肺 骨骼	1.0-7.0毫微居里/克肺78	肺癌 骨肉瘤

表10-27　几种亲骨性核素引起狗骨肉瘤的相对生物效应

核　素	射线种类	能　量 （兆电子代）	相对生物效应	下限剂量 （拉德）
239Pu	α	5.15	6	200
238Th	α	5.42	8	150
226Ra	α	4.79	1	1200
90Sr	β	0.54	0.07～0.24	5000～17000

第五节　药理学研究中实验动物的选择与应用

一、中枢神经系统药理学研究中的选择与应用

（一）镇静催眠和抗精神病药物实验

1．实验动物的选择：研究动物行为药理学最常用的动物有小鼠、大鼠、猫、鸽、猴等。实验时常用两个种属的动物。第一种是用实验比较方便的动物，如小鼠、大鼠。第二种是用非啮龄类动物，最好选用猴子或猩猩。选择动物时应注意各种系动物的特点。第二种适用于作刺激研究，因为大鼠视觉、嗅觉较灵敏，做条件反射等实验反应良好。但大鼠对许多药物易产生耐药性。猫和狗的自然行为多样而稳定，常用于神经药理、神经生理以及生为观察的补充实验。猴子和猩猩则更接近于人类。大鼠和小鼠的活动在夜间比白天多，故研究中枢神经抑制药在夜间进行实验较好。不同种属的动物对药物的反应可以有明显差异。如吗啡对大鼠、兔、狗和猴的作用是抑制性的。便对小鼠、猫、鹅和马的作用是兴奋性的。所以做实验时要包括不同种属的动物。

2．药物对动物一般活动的影响：常用且简易的方法是采用直接观察法，观察动物的一般行为和特殊情绪，如激怒、躁狂、瞳孔大小、对捕捉抵抗等行为。为便于记录，可用评定行为改变和行为分级的方法，采用定性和定量来记录动物行为。如常用Norton对猴、猫、地鼠的行为定量分级，将对照组和用药组动物进行定时观察，并按下述行为分级法打分记录（表10-28），求出每组平均数，进行七检验，确定有无显著性。

表10-28　Norton行为分级法

动物		地　鼠	猴	猫
活动分级
一般活动：	1	张　口	呼　噜　声	跳
	2	推动粪便	温　驯	喵　喵　叫
	3	吃　食	跟着观察者	走　动
	4	紧贴身子睡	取　东　西	站　立
	5	睡　眠	走　动	竖　尾
满　足：	6	排　尿	玩　耍	清洁身体
	7	搔　抓	叫	揉　捏
	8	吃　食	修饰动作	呜　呜　叫
	9	清洁身子	吃　食	触　摸
	10	抬　头	休息（坐）	休　息
兴　奋：	11	取　食	吱　吱　叫	嚎　叫
	12	走　路	张　口	竖　毛
	13	爬　行	跳	甩　尾
	14	攫　取	格　格　声	瞳孔扩大
	15	嗅	注　意　听	多　动
防御动作：	16	排　便	缩　回	咆　哮
	17	踢	排　尿	嘶　嘶　叫
	18	吱　吱　叫	咬　牙	耳　动
	19	站起防御	撒　回	缩　回
	20	左右摇晃	张　嘴	踡　曲
激怒动作：	21	粗　叫　声	怒　叫	猛　扑
	22	拖　拉	低　头	站　立
	23	追　逐	踡　缩	咬
	24	咬	向前猛冲	抓
	25	站　立	拍　击	拍　击

3．常用催眠药对各种动物的影响：各种动物的催眠剂量见表10-29。

表10-29　药物对各种动物的催眠剂量（荻原弥四郎1971）

药　物	静脉注射的催眠剂量（mg/kg）
	小白鼠	大白鼠	豚鼠	兔	猫	狗	猴
异戊巴比妥钠	54	55	50	40	40	50	40
巴比妥钠	234	190*		175	200	220
戊巴比妥钠	35	25	30	30	25		25
环已巴比妥钠	47	75*		25	25	30
苯巴比妥钠	134	100	100*	200	180*	80	100*
司可巴比妥钠	30	17.5	20	22.5	25		175
水合氨醛	400*	300*
副　醛	120　250*	550*	110	80225*	100	125
乌　拉　坦		780*	1500*	1000 1000*	1250 1500	1000
氯　醛　糖	114*	55*	175*	120	70.50*	100

*表示腹腔注射

（二）抗精神病药物的行为实验

去水吗啡能增强大白鼠舔、嗅、咬等定向行为，这是由于药物增强黑质--经纹状体脑内多巴胺（DA）能系统功能的缘故。安定剂抑制大白鼠的定向运动的作用强度与安定剂抑制脑内DA能受体功能有相关性。常选用150～200克大白鼠，皮下注射去水吗啡2mg/kg，作定向运动强度实验。

去水吗啡引起的攀爬行为是动物黑质－纹状状体系统内DA能功能增强的表现。Costentin发现小白鼠注射去水吗啡后喜欢垂吊在铁丝网上，应用安定剂可拮抗去水吗啡引起的小白鼠垂吊现象，这一拮抗作用与安定剂作用的强弱有较好的平行关系。

僵住症是动物锥体外系运动功能失调的一种表现，常选用150～200克大白鼠作此实验。

（三）抗惊厥和抗震颤麻痹药实验

1．化学物质引起惊厥法：常选用小白鼠，也可采用大白鼠，猫或兔则可作特殊观察。采用戊四唑惊厥法，在小鼠皮下注射85mg/kg（最大也有用150mg/kg，此剂量已是LD₉₈），腹腔注射为100mg/kg（最大175mg/kg）作实验时，不同种系小鼠可有不同反应，Bastian曾比较过由8处供应的4个种系的小鼠，其中CFW种小鼠在持续惊厥后立即死亡的发生率为100%，而其它3种有10～30%动物在持续惊厥后存活很长时间不死亡。因此作药物活性比较时，应选用同一品种。

2．听源性发作法：某些敏感动物（主要是鼠类）在受到强铃声刺激时，能产生一种定型的运动性发作，称为“听源性发作”（Audiogenic　seizure），这是研究抗癫痫药物的一种常用模型。如果选用DBA/2J系小鼠（听源阳性鼠）供科研用。也可采用一些药物来提高大鼠听源性发作阳性率。如在亚惊厥剂量的戊四唑（16mg/kg）、士的宁（1mg/kg）、若味毒（1mg/kg）或咖啡因（150mg/kg）作用基础上，给予铃声刺激，可使部分听源阴性鼠也能产生发作。上述药物所致的阳性发作率分别为47.%、66.5%、38.4%、18.1%。

3．慢性实验性癫痫模型：各种动物的大脑皮质感觉动物区是致痫敏感区之一，特别是猴极易在此区形成癫痫病灶。将铝剂注入到中央前回和中央后回比单注入中央前回易于形成；将铝剂注入到猴和猫的颞叶前部，可引起运动性和精神运动性发作；大脑皮质其区区域不敏感。此外，还报导注于杏仁壳核也可引起发作。病理模型的形成以猴最为敏感，猫次之，其他动物不敏感。所以，常选用猴作此实验，麻醉后无菌条件以猴最为敏感，猫次之，其他动物不敏感。所以，常选用猴作此实验，麻醉后无菌条件下将消毒后的4%氢氧化铝乳剂用皮内针头注到前脑和后脑皮质感觉运动区，注射两点或数点，勿使药液外流于软脑膜内，可在注后35-60天，出现自发性癫痫发作。如果铝剂形成的病灶严重，也可在注后2-3周发作。

钴可引起大白鼠、小白鼠和猫的慢性实验性癫痫，而猴对钴却不敏感，常选用大白鼠，在麻醉消毒下，开颅将消毒的市售钴粉（200筛孔）约30mg，放在皮层运动区的前侧（面积为10mm2），安好电极，缝合，动物约在放置钴粉后2～3周，出现置钴对侧肢体发生阵挛，少数动物于局部阵挛后出现全身发作。

点燃效应（Kindling　Effect,KE）引起发作是一种较好的慢性实验性癫痫模型。其形成方法是以一定的刺激强度和时间间隔刺激脑的一定部位。动物常选用大白鼠、猫、猴、兔等。刺激强度：大白鼠杏仁核和海马为50～400μA，猫为100～500μA，猴和狒狒为200～400μA。

4．抗震颤麻痹药物筛选方法：目前筛选抗震颤麻痹药物的方法，常采用药物诱发震颤和损伤锥体外系某些核团以诱发震颤。如常选用豚鼠药物诱发震颤法，按0.002%水杨酸毒扁豆碱溶液以0.3mg/kg剂量注往前右侧颈动脉，注射速度要严格控制在20～25秒之间，并在注射时暂夹住左侧颈动脉，以保证药液进右侧椎动脉。动物多于注射毒扁豆硷后15～20秒出现症状，典型阳性反应是头左偏，身体强迫性向左侧旋转作环形运动，同时可伴有眼球左偏并向对侧震颤，全部症状持续5分钟。还可选用小白鼠，按25mg/kg腹腔注射0.25%槟榔硷溶液；腹腔注射0.5%匹鲁卡品，50mg/kg；腹腔注射0.0014%氯化震颤素0.14mg/kg，均可出现明显震颤。

（四）镇痛药物实验

目前国内外筛选镇痛药的常用致痛方法，概括有物理性（热、电、机械）和化学性刺激法。这些方法各有优缺点，其中以热、电刺激及钾离子皮下透入致痛法使用居多。常用的动物有小白鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、狗、猴等。动物实验中常用的痛反应指标为嘶叫、舔足、甩尾、挣扎及皮肤、肌肉抽搐等。

应用猴子研究镇痛剂的依赖性较为理想，因为镇痛剂对它的信赖性表现与人较接近，戒断症状又较明显且易于观察，已成为新镇痛剂进入临床试用前必须的试验。

（五）解热、抗炎药实验

炎热和炎症都是临床常见的症状。实验室常用病毒、细菌、细菌产物、内毒素和抗原抗体复合物引起发热，也有用微量前列腺素（PGE）直接注入动物脑室或丘脑下部原抗体复合物引起发热，也有用微量前列腺素（PGE）直接注入动物脑室或丘脑下部进行致热。

常用的致炎方法有以血管通透性增加为主的足蹠浮肿法、无菌性胸（腹）膜炎、佐剂性关节炎、紫外线红斑法、放射线照射法以及其它菌性炎症；有观察白细胞游走的羧甲基纤维素囊法、大白鼠角膜法、毛细管法和小室滤膜法；有制造肉芽肿模型的棉球法、纸片法、琼脂法、巴豆油囊袋法和受精鸡卵法等。此外亦有用妊娠大白鼠子宫自发收缩为指标，间接反应炎症过程的方法。

实验性炎症应该选用哺乳类动物，并根据实验模型的不同采用不同种属的动物。例如足跖浮肿模型须采用大白鼠，形成过敏性炎症应首选豚鼠，而家兔则最易产生发热反应。此外，幼小动物（如小狗、小兔、小白鼠）炎症反应相当微弱，甚至可以完全不出现。家兔对刺激的炎症反应与其毛色有关，白毛兔比有色毛兔的炎症强度和炎症经过均较剧烈。曾致炎组织比初次炎症刺激时反应微弱，因此不宜在同一部位反复复制炎症。

动物种属、年龄和形态特点，对发热反应有明显影响。例如小白鼠、豚鼠，有时包括大白鼠，均不宜用于复制发热模型。这些动物的恒温机能差，对发热刺激的反应低，有时对热源性物质的刺激体温反而下降。而兔的发热反应典型恒定，因而常用。但须注意，家兔年龄在20～30天以内者可不发生发热反应，而体重在2kg左右者，结果最为满意。大白鼠则以体重150～200g为最适宜。同种动物形态上的差异也会影响到体温反应，如毛家兔和长毛狗的体温比短毛者上升的慢。狗对外界环境的变动反应稳定，但小白鼠和大白鼠的体温波动很大。动物长时间捆绑时，体温可显著降低。当动物挣扎时则可使体温升高。因此通常把动物固定在木盒内，以限制其多余的活动。给动物注射菌液或内毒素时，注射量并不与发热反应强度成正比。注入量过大时的体温可不上升，故剂量的选择必须恰好处。静注菌液或内毒素等引起的发热较皮下注射迅速而强烈。但注射化学刺激剂则必须注射到动物皮下才会引起较强反应。可能是该类物质刺激皮下组织造成无菌性炎症所致。

（六）中枢兴奋药实验

去水吗啡对不同种属动物具有不同的作用，对某些动物（如狗、猫）可引起顽固性呕吐；对另一些动物（如马、牛、啮齿类动物）则可引起惊恐、运动性增高和强制性的啮齿动物（Guawing）；鸽则引起强烈性的啄凿。为了研究药物对去水吗啡的作用，多认为选用具有温和啮齿作用的小白鼠为宜。以观察药物能否拮抗去水吗啡引起的小白鼠啮齿动作，来测定其中枢兴奋的强度。

引起食欲抑制的药物大多为中枢兴奋药，所以测定药物对动物食物摄取量的影响。可作为中枢兴奋药的筛选指标之一。常选用猫来研究食欲抑制药物有无耐药性及其发生速度。亦可选用小白鼠或采用全硫葡萄糖（Aurthioglucose）喂饲的小白鼠肥胖模型来研究食欲抑制药。

二、传出神经药理学实验中的选择与应用

（一）一般实验方法和动物的选择

在测定新药的急性毒性实验（LD₅₀）时，动物如出现竖毛，活动增加，激动兴奋，以致发展为强直一阵挛性抽搐，可初步考虑为拟交感药。进而可观察其动物（或猫）血压的反应，如兴奋α-受体，则对血压影响较大，并反射地使心率减慢，如兴奋β受体，可见血压下降和心率明显增快。为了较确切地区分其对α、β受体的作用，还可采用α受体阻断药酚妥拉明，β受体阻断药心得安等作为工具。除血压实验外，尚可采用猫瞬膜，猫（或狗）在体肠活动等实验方法。利用一些体外实验可分析拟交感药的作用部位，其中最敏感的实验之一是大白鼠胃底条，此外有兔头肌、离体兔耳、豚鼠气管链、豚鼠回肠和鸡盲肠等制备。可用已知的α或β-受体兴奋剂作为标准，观察它们与α或β-受体阻断药的相互作用，而确定其作用部位。

乙酰胆硷具有毒蕈碱样及菸碱样作用，前者可被阿托品阻断，后者可被神经节阻滞药及横纹机松驰药阻断。凡是通过直接或间接作用兴奋副交感效应点的药物可出现流泪、流涎、排尿和排便症候群。因此在小白鼠LD₅₀实验中可获得初步印象，进而分别观察其对血压、唾液、瞳孔及胃肠道等反应。在猫血压实验、蛙心、蛙腹直肌、水蛭背肌等标本上可检定拟胆碱药和观察抗胆碱药的作用，亦可用整体实验如抑制大白鼠胃溃疡，抑制大白鼠肠内活性炭下移等方法观察之。

（二）心血管实验

血压实验是检验传出神经药物极其敏感的方法，一般采用急性血压实验，动物中以狗、猫、兔和大白鼠常用。兔不适用于降压实验，因其易于死亡。实验可用麻醉或毁脑动物，因麻醉动物的血压常有三级波动（第一级波动，又称脉搏性波动，系每次心搏影响血压所致，第二级波动，又称呼吸性波动，即吸气时，血压微升，呼气时血压微降；第三级波动，系血管运动中枢以稍长间隔，兴奋性周期性改变），使血压升降不稳。如动物毁脑后，可排除脊髓以上的中枢神经神经对血压的影响，只出现第一级波动，血压曲线极不平衡。

离体兔主动脉条实验：兔主动脉上含有α-受体，它是测定作用于α-受体药物的一个很好标本，已被广泛用来鉴定和分析拟交感药及其对抗药的作用。兔主动脉制备曾试制过多种形式，如主动脉环、片及条状等，但兔主动脉螺旋条是最合适的方法之一。此标本有较多优点，如一个主动脉可制作3～4个标本，可供配对试验，对低浓度拟交感药就很敏感，组织稳定性好，可维持较长时间。

（三）消化道平滑肌实验

多种动物的离体肠道可用来试验传出神经药物，一般多用离体豚鼠及兔的肠道。豚鼠回肠的自发活动较少，描记时有稳定的基线，适合作药物鉴定用。兔肠（尤其空肠）具有规则的摆动运动，适用于观察药物对此动物的影响。豚鼠回肠标本加负荷后已完全松驰，因此加入拟交感药不会使其更松驰。

离体豚鼠回肠可用于观察乙酰胆碱（Ach）和拟胆碱药的剂量－反应关系；可检定Ach和拟胆碱药的含量。离体兔空肠有节律性收缩活动，可观察肾上腺素（4μg）、去毒豆碱（2μg）等药物对空肠摆动运动的影响。大白鼠胃底条是检定儿茶酚胺类药物和5-羟色胺（5-HT）最敏感的标本。主要观察药物对胃纵行肌的作用，因标本中环形肌已切断。经检定儿茶酚胺对其敏感度要比大白鼠子宫标本大10～100倍。鸡食道由副交感神经支配，因此离体鸡食道标本适合于试验拟副交感药物。由于其作用不能完全被神经节阻断药所阻滞，故不宜用于试验作用于神经节的药物。

（四）其它平滑肌等实验

大白鼠子宫中肾上腺素能受体主要是β-受体，最适用于试验β兴奋剂和β-阻断剂。它对异丙肾上腺素最敏感，肾上腺次之，对去甲肾上腺素极不敏感，因此亦可用来检定含肾上腺素与去甲肾上腺素的混合液中前者的含量。

虹膜括约肌受副交感神经支配，当此神经兴奋或应用拟胆碱药时，瞳孔缩小，抗胆碱药使瞳孔散大，虹膜辐射肌受交感神经支配，此神经兴奋或应用拟交感药后使瞳孔散大。因此可利用动物的瞳孔来测试某药系拟胆碱药、抗胆碱药或拟交感药。常选用兔和猫的瞳孔进行试验。猫瞳孔对药物反应较灵敏。不麻醉狗的瞳孔不稳定，拟交感药对其作用极短暂。

离体猫脾条对儿茶酚胺类很敏感，适用于检测拟交感药和α-阻滞药。脾条对拟交感药的反应较慢，开始迅速收缩后，即慢慢上升，3～5分钟收缩达高峰，恢复亦慢，即使接触低浓度的拟交感药，亦需5分钟恢复，如用引起最大反应的浓度时，常需2小时才恢复。此标本对异丙肾上腺素不敏感，一般浓度达2×10-5M才出现反应，5×10-2M达最大反应。

水蛭的背肌和蛙复直肌一样，Ach使之收缩，用毒扁豆毒碱处理后，对Ach敏感性大增，此时Ach的剂量即使低到10^-5M或以下，亦能使悬于5ml浴槽中的肌肉收缩，因此适用于测试微量的未知拟胆碱药。亦适于测定刺激神经（如猫颈上神经）后释放的Ach量。

蛙复直肌标本可用来检测阻断神经肌接点的药物反应和检定Ach和拟胆碱药，方法简便易行，结果较正确。但在检定Ach时，在有毒扁豆碱存在的条件下，其敏感性不及豚鼠回肠和水蛭背肌。

（五）影响传出神经递质的药物实验

1．猫瞬膜：猫的瞬膜形大且反应灵敏，因此是进行瞬膜实验首选和最适合的动物。狗和兔虽然也有瞬膜，但形小，用药后变化较小，且兔的瞬膜反应性有不同，故后两种动物一般不采用。瞬膜由颈上神经节后纤维支配，属肾上腺素能神经，瞬膜内存有α-受体。猫的瞬膜标本在鉴别神经节阻滞药和α-受体阻滞药研究中也是常用的方法之一。如受试药物是神经节阻滞药，则刺激节前纤维和注入酰胆碱均无瞬膜反应，而刺激节后维或注入去甲肾上腺素仍有瞬膜反应。若受试药物是影响递质的，则刺激节前纤维、节后纤维或给乙酰胆碱均无瞬膜反应，给去甲肾上腺素瞬膜反应仍存在，甚至增强其反应，以资鉴别这两类药物。

2．兔肠系膜神经：离体兔肠系膜神经一回肠实验常选用兔的回肠制备较为合适，因为兔肠的摆动动物（钟摆运动）波辐射较大。豚鼠的肠制备也可用，但摆动波辐小，用药后抑制反应不易看出。猫、狗等肠壁厚，对儿茶酚胺类药物和其它药物反应迟钝，故不选用。刺激肠系膜神经（系肾上腺系能神经）可抑制回肠的摆动运动。如受试药物能阻断这一抑制反应，而不影响甚至增强去甲肾上腺素或肾上腺素对回肠摆动运动的抑制作用，则可推断该药是肾上腺素能神经阻断滞药。

3．兔耳：兔耳灌流法是筛选肾上腺素能神经阻滞药和α-受体阻滞药常用的方法之一。前一类药物能抑制耳大神经刺激引起的血管收缩反应，使灌流量增加，但去甲可肾上腺素或肾上腺素引起的血管收缩反应反而增强，使其灌流量减少。根据上述作用，可以鉴别这两类药物。根据1960年Hukoric在离体兔耳灌流研究中认为耳大神经除含有肾上腺素能神经外，还有少部分胆碱能神经。用肾上腺素能神经阻滞药后胆碱能神经的作用表现得更充分，因此，在实验设计中，用阿托品8μg阻断其毒蕈碱样作用，使其不干扰肾上腺素能神经阻滞药物研究。

4．猫脾神经：脾神经-脾标本制备在肾上腺素能神经阻滞药或α-受体阻滞药的研究中是常用的方法之一。前一类药使用后，刺激神经，使脾静脉血中去甲肾上腺素含量降低；后一类药使用后，则使去甲肾上腺素含量增加，以此来鉴别两类药物。常选用猫来作此实验。

5．豚鼠下腹神经－输精管：下腹神经是交感神经节后纤维，支配输精管或子宫。该实验在研究肾上腺素能神经阻滞药和α受体阻滞药中是常用的方法之一。受试药物能阻滞刺激下腹神经引起的输精管或子宫收缩作用，却不能影响去甲肾上腺素或肾上腺素的反应，甚至可增强其作用，则可确定该药为肾上腺素能神经阻滞药。豚鼠的输精管对交感胺的收缩反应较子宫迅速，洗去后恢复也较快，因此常选用豚鼠作此标本进行试验。

6．兔交感神经－心房：离体兔交感神经－心房标本主要用于观察肾上腺素能神经阻滞药的作用。刺激交感神经，引起心率加速，收缩力加强。这类药使用后，阻断上述反应，但不能对抗去甲肾上腺素或肾上腺素对心脏的兴奋作用。此标本制备除主要选用兔外，小猫（1～2Kg重）、豚鼠也可采用。

7．大白鼠血压：R.Lesic等在大白鼠血压实验中发现毒扁豆碱能引起升压反应，而在狗、猫、鼠等实验动物中，该药主要引起降压反应。利血平能阻断大白鼠对毒主扁豆碱的升压作用。切除两侧肾上腺，不影响其升压反应，便横断脊柱，其升压反应立即消失。因此，他们认为大白鼠对毒扁豆碱的升压反应可能是中枢性的，再通过外周交感神经表现出来。毒扁豆碱引起的大白鼠升压反应的实验模型可用来研究影响肾上腺素能神经递质释放的药物。如某药物使用后，再注射毒扁豆碱，其升压作用消失，便去甲肾上腺素或肾上腺素的升压作用仍不变，甚至增强，则可能提示该药为肾上腺素能神经阻滞药。

（六）作用于胆碱受体和肾上腺素受体的药物实验

胆碱受体有M和N两种，当M受体兴奋时，表现为心率减慢，心收缩力减弱，血压下降，胃肠道平滑肌收缩，瞳孔缩小，唾液分泌增加，支气管平滑肌收缩等，已知典型的M受体阻滞药阿托品等能阻滞上述作用。欲确定一个未知药是否作用于M胆碱受体，其作用性质是兴奋、抑制或阻断，可选离体豚鼠回肠、兔的瞳孔、兔的唾液腺分泌、大鼠或猫的血压、离体蛙心和离体兔右心房等实验，与已知药匹鲁卡品或阿托品对照，即可获得明确结论。N-胆碱受体分为N₁和N₂两种。N₁胆碱受体兴奋时，植物神经节兴奋及肾上腺髓质分泌。在阿托品化猫，凡不具有血管收缩作用而能使血压升高的药物，初步可认为其作用部位在N1胆碱受体。N2胆碱受体兴奋时骨骼肌收缩，可采用水蛭背肌或蛙腹直肌标本实验，即能得到结果。

二苯羟乙酸奎宁酯（Quinuclidiny1Benzilate,QNB）是一个M-受体阻滞药，它能与M-胆碱受体紧密结合，维持时间较长，为研究M-胆碱受体提供了一个有效的工具。节后拟胆碱药或节后抗胆碱药都能与M-胆碱受体结合，因此均可降低³H-QNB的结合率。常选用豚鼠的回肠作此实验。此外，还可选用豚鼠的心脏、肺脏、脑及脾脏，这些组织匀浆均具有与³H-QNB结合的M-胆碱受体。但在肝脏、肾脏及隔肌则不存在与³H-QNB结合的M受体。

肾上腺素受体有α和β两种，当α受体兴奋时，表现为皮肤、粘膜及内脏压管收缩，胃肠道平滑肌松弛，瞳孔散大，瞬膜收缩，子宫收缩等。已知典型的α受体阻滞药酚妥拉明和妥拉苏林等能阻断上述作用。常选用离体兔主动脉条、离体豚鼠或大鼠输精管、离体猫脾条、离体大白鼠胃底条、离体兔空肠等作α受体作用实验。β受体兴奋时，表现为心率加快，心收缩力加强，传导加速，骨骼肌血管和冠状动脉扩张，胃肠道平滑机松弛，支气管扩张，糖原和脂肪分解等。由于β受体又分β₁、β₂两种，对于这两种亚型受体作用的观察，一般是以心脏效应作为观察β₁受体作用，而以气管、支气管效应作为观察β₂受体作用。已知典型的β受体阻滞药心得安等能阻断上述作用。常选用离体蛙心、离体原位蛙心排出量、兔心灌注、在位猫（或兔）心实验、兔（豚鼠）离体心房实验、离体大白鼠子宫、离体豚鼠气管片等作β受体作用实验。

未妊娠兔的离体子宫对α受体兴奋药十分敏感，可使之强烈收缩，故可用于鉴定α受体兴奋药或阻滞药。脂肪组织存在β受体，凡能兴奋β受体的药物均能引起游离脂肪酸的释放增加。如预先加入β受体阻滞药，则可使游离脂肪酸的释放量明显减少，甚至完全阻断，故此法亦用来鉴定作用于β受体的药物。常选用不饥饿的雄性大白鼠，麻醉下取其副睾脂肪垫作实验。子宫平滑肌收缩为α受体兴奋反应，目前常选用兔子宫平滑肌膜与³H-DHE（即³H-Dihydrocryptne,是一个α受体阻滞药）进行体外培养，³H-DHE与子宫平滑肌膜上α受体结合，25℃不超过17分钟，即能完全达到结合，而且结合稳定性较好，至少可维持39分钟，常用来鉴定α受体。

（七）骨骼肌松弛药实验

在进行神经肌接点阻断药试验研究时，动物品种的选择是十分重要的，因神经肌接点阻断药的效应有明显的动物种属差异，只有选用在反应性质和程度与人相似的动物进行实验，所得结果才对临床用药有较高的参考价值。

不同种动物对同一种神经肌接点阻滞药的反应不同，如猫、狗、兔、大白鼠对十烃季铵和筒箭毒的敏感性各不相同，其间差异见图10-8、表10-30所示。不同种属动物对神经肌接点阻断药反应的差异不仅表现在作用强度上，而且反应在作用性质上，如猫对琥珀酰胆碱、十烃季铵的反应与人近似，呈单纯去极化型阻断作用，而在兔、豚鼠、大白鼠常表现为双相阻断作用。鸡对十烃季锓特别敏感，大白鼠对筒箭毒敏感，人对十烃季铵与筒箭毒的反应介于猫对狗之间而与猫近似。虽然蛙、兔、小鸡、小白鼠等动物在神经肌接点阻断药的试验研究上各有应用价值，如蛙可在不用人工呼吸的条件下作用于观察神经肌接点阻断药的作用，小鸡可用于区别去极化型阻断药与非去极化型阻断药，兔垂头法可用于观察神经肌接点阻断药的效应和鉴定其效价，小白鼠用于神经肌接点阻断药的初筛，但以猫对神经肌接点阻断药的的反应与人最近似，故猫是必不可少的试验动物，但也不是一切试验均需要在猫身上进行。

图10-3不同种实验动物对十烃季铵和筒箭毒的敏感性

表10-30　一些神经肌接点阻断药对人、猫、大白鼠的相对效价*

动　物	人	猫	大　白　鼠
氯化筒箭毒	1/(10mg)	1/(0.4mg/kg)	1/(0.07mg/kg)
三乙基碘化格拉明	0.2/(50mg)	0.26/(1.5mg/kg)	0.02/(3.5　mg/kg)
甲基硫酸劳德克辛	0.5/(20mg)	0.7/(0.6mg/kg)	0.04/(2　mg/kg)
氯化苯唑醌铵	1/(10mg)	1.6/(0.25mg/kg)	0.07/1　mg/kg)
碘化十烃季铵	4.5/(2.24mg)	10/(0.04mg/kg)	0.04/2　mg/kg)
氯化琥珀酰胆硷	1/(10mg)	8/(0.05mg/kg)	0.07/1　mg/kg)
溴化氨酰胆硷	4.5/(2.24mg)	20/(0.02mg/kg)	0.05/1.5　mg/kg)

*每格中上面数字是以筒箭毒用为1m算出的相对强度。插号中数字为产生90-95%神经肌接点阻断作用所需剂量。

三、心血管系统药理实验中的选择与应用

（一）血压测量

插管直接测压法：在研究中经常应用动物急性血压试验来分析药物等对循环系统的影响，常用的动物有狗、猫、家兔和大白鼠。猴、羊、豚鼠、小鼠、鸡、鸟和蛙的血压值和急性测压法虽有报告，但极少用于药物对血液循环影响的常规研究。各种动物的血压值可参看表10-31。

表10-31　各种动物的血压值

动物种类	动物数与性别	麻醉情况	血压（mmHg）
			收　缩　压	舒　张　压
猴	14	不麻醉 -	159（137～188） 124～175	127（112～152） 105～138
马	173♂ 43♀ 青年5♂ 3♀	不麻醉 ″ ″ -	98（90～144） 90（86～98） 80 80～90	64（46～86） 59（43～84） 50 50～65
牛	- 青年4 -	不麻醉 - -	134（124～166） 157（133～177） 134	88（80～120） 88
山　羊	- -	不麻醉 -	120（112～126） 80～120	84（76～90） 42-84
绵　羊	13 -	局麻	114（90～140） 114	68
猪	- -	不麻醉 -	169（144～185） 170	108（98～120） 110
狗	13 22 67♂ 80♀ -	不麻醉 戊巴比妥钠 巴比妥钠 ″ -	112（95～136）　56（43～66） 149（108～189）　100（75～122） 134（85～190） 125（60～170） 80～180　45～100
猫	5 191♂ 208♀ -	巴比妥或乙醚 戴爱尔或氨基 甲酸乙酯 ″ -	120　75 129（67～216） 121（62～200） 120～155　75～100
兔	32 -	不麻醉 -	110（95～130） 70～150	80（60～90） 60～90
豚　鼠	8 -	乙醚、戊巴比妥 -	110（28～140）　47（16～90） 81～90
田　鼠	-	-	90～170
大　鼠	124 100 -	戊巴比妥钠 不麻醉 -	129（88～184） 98（82～120） 60～150	91（58～145） - 60～110
小　鼠	9 青年19 -	氨基甲酸乙酯 或乙醚 不麻醉 -	113（95～125） 117（95～138） 90～160	81（67～90） - 70～110
金地鼠	-	戊巴比妥纳	120～170
鸡	-		88～170
鸭	-	-	88～170
鹅	-	-	88～170
鸽	-	-	135
鲤　鱼	-	-	43
蛙	-	-	20～60	20～40
蟾　蜍			48

大白鼠血压除对个别药物（如毒扁豆碱）反应异常外，对绝大多数的升压和降压物质的反应都和人或大动物（如狗、猫）是一致的，并且反应十分灵敏，目前它是检定体液或组织中去甲肾上腺素等升压物质含量的常用动物之一。大白鼠来源容易解决，较经济、用药量少、所占工作面小。缺点是动物小，操作较因难，血管较细小，易发生血液凝固，故须预先注射肝素抗凝。用狗作实验优点很多，如血压恒定，较大白鼠、家兔等小动物更接近人体，对药物反应灵敏并与人基本一致；血管和神经较粗，管壁弹性强，便于手术操作和适用于分析药物对循环系统的作用机制；心搏力量强，能描绘出完好的血压曲线；用作药物筛选时，可反复应用。缺点是来源较困难，人体贵，不适用于需要动物数量较多的实验。猫用于血压试验时除有与狗相同的优缺点外，特别值得指出的是更适用于药物对循环系统作用机制的分析，因为猫不仅有瞬膜，便于分析药物对交感神经节和节后部分的影响，而且易于制备脊髓猫以排除脊髓以上的中枢神经系统对血压的影响。此外，猫体重较狗轻（实验可用1.8～2.5kg体重的猫），用药量较省。家兔来源容易，性情温和，故亦常用血压试验。但并不理想，因为家兔为草食动物，个体间血压差异大，对药物反应不及上述各种动物恒定和灵敏，较脆弱，尤其是长毛大耳家兔易死亡，故它不适用于血压试验，血管较小和心搏力量较弱，插管内易发生血凝块。而且约有20～30%的家兔在颈动脉上向甲状腺分出的一根小动脉，碰到这一情况，宜将此分枝反线结扎剪断，否则在其上方插入动脉插管后，当检压计加压或开放动脉夹时，较大量的枸橼酸钠可经过此侧技，造成家兔深吸气和血压激烈波动，枸橼酸钠倒入心脏而死亡。

不插管（间接）测压法：在不插管测压法中最常用的动物是狗、大白鼠和家兔。大白鼠不插管测压法，常选用大白鼠尾容积测压法、鼠尾搏动投影响测压法和鼠脚测压法。狗不插管测压法选用颈动脉皮桥法、胫动脉间接测压法和股动脉穿刺测压法。家兔不插管测压常选用颈动脉皮桥测压法和兔耳测压法。

（二）实验性高血压

1934年，Goldblatt曾证实，狭窄狗肾动脉可产生持续性高血压，这一实验研究引起了人们的普遍重视。随后，世界各地相继开展了高血压病的动物实验研究，建立了不同的高血压动物模型，并提出了各种有关高血压病病原的学说。急性实验性高血压模型，常选用的动物有狗、猫、大白鼠、家兔和猴等。引起急性实验性高血压的方式很多，如直接刺激中枢神经系统、通过神经反射、外源性儿茶酚胺类或其它体液性加压物质的注射等。实验一般多在麻醉动物身上进行。

直接刺激中枢神经法，采用埋藏电极或借助于立位定各器，是刺激大白鼠或猴的侧下丘脑防御警觉区，可使动物血压明显升高，心率加快和心输出量增加等。神经反射性高血压可选狗进行，以波长0.1毫秒、频率5～50次/秒的方波刺激狗的隐神经、喉上神经或精神迷走神经中枢端，刺激时间为15秒，可使狗的收缩压和舒张压均升高20～100mmHg。肾源性加压物质的注射法，选用大白鼠、家兔或狗，实验前将动物两侧肾脏摘除，手术后几小时或经24小时后，给动物静脉注射或滴注肾提取物、肾素或人工合成的血管紧张素（Angiotensin）均可使血压明显升高。切除动物肾脏后几小时，血中血管紧张素原（Angiotensinogen）即开始上升。24小时后可增达高峰，大白鼠血中血管紧张素原值可增加14～15倍，狗约增加3倍。从而大大提高了动物对外源性肾脏加压物质的敏感性。体液性加压物质注射法，选用狗、猫或兔按2～8μg/Kg剂量静脉注射肾上腺素或去甲肾上腺素时，可引起血压显著而短暂的升高。给大白鼠静脉注射0.5～3μg肾上

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神经原型高血压，可选用狗、大白鼠和家兔等，通过机能性方法或物理方法作用于动物神经系统而诱发条件反射性高血压和皮层性高血压模型。选用出生后的小白鼠诱发隔离性高血压，如采用大白鼠隔离饲养，高血压发生率和血压升高程序均不及小白鼠显著。大灰鼠长时期处于噪音或钥匙叮噹响声刺激造成的听源性紧张情况下，可诱发神经原性高血压，它与人的高血压病相类似，适用于降压药物的筛选。大灰鼠正常平均收缩压±标准差为113±8mmHg，噪音刺激3个月后升高到130～140mmHg，有40%的动物收缩压高达160mmHg。采用大白鼠与家鼠杂交所生的大灰鼠，比纯种大白鼠较易起听源性高血压。大灰鼠以选用120天年龄的适宜。选用狗或兔小脑延髓池内注入白内陶土生理盐水混悬液，可使动物颅内压升高，随后血压亦逐渐升高，血压高峰值可超过原值50～80mmHg，并可恒定地维持几个月，但此法诱发高血压的百分率不超过半数。去抑制性高血压，常选用家兔，切断其主动脉的减压神经，或选用狗，切断颈动脉窦区神经所引起的高血压。采用狗进行实验时，最好选择宽脸面的狗，因为这种狗较易找到颈动脉窦。

肾性高血压，常选用狗、家兔和大白鼠，将动物一侧肾动脉狭窄，肾动脉血流量减少50%以上或同时狭窄两侧肾动脉，均可导致血压长期升高。狭窄家兔肾动脉分枝部上方的腹主动脉，或造成肾脏小动脉及其分枝的多发性栓塞，均可形成高血压。采用玻璃纸或橡皮?

■［此处缺少一些内容］■

选用狗、猫、家兔、豚鼠和大白鼠。测量时麻醉要选择好，家兔、豚鼠及经过训练的狗等可不用麻醉记录清醒状态下的心电图。有时为避免动物挣扎，特别是某些药物刺激动物引起挣扎时以及小动物如大白鼠、小白鼠则需加用全身麻醉。常用的戊巴妥钠对心脏有一定抑制，特别是当静脉注射快时，可加快心率，使ST段移位，T波倒置。吸入性麻醉药氯仿对心脏毒性大，除非为引起心律失常，不可用于心电图麻醉。乙醚能加快心率，氟烷减慢心率，乌拉坦和氯醛糖对心脏毒性较小。在麻醉深度方面宜保持稳定，补加过量麻醉药可影响心电图。体位对心电图波形有影响，故应选择适当体位。小动物如豚鼠甚至头的位置都影响心电图波形。狗的前肢和肩部位置对心电图波形式影响最大，故在实验过程中应保持固定体位。麻醉动物一般用仰位固定，便于安放胸前电极。但也有人认为麻醉大白鼠以俯位固定为好。清醒动物用俯位固定较少引起挣扎，驯服的狗可安静地在实验台上记录心电图；如有挣扎，可用特制的布兜托在腹下，四肢从布兜的四个孔穿出，将狗悬吊在狗架横梁上，狗四肢离地，可减少挣扎。狗经过训练可避免挣扎。测量动物心电图用的电极，一般常选用皮下针头电极，即把电极联接于注射针头或针灸用细针刺入动物皮下。要注意针头与电极的联接必须十分紧密，接触良好，否则容易产生干扰，以致记录失败。宜选用6～7号大小的注射针头。针头的头部必须干净无血污。为使之与电极密切接触，需内垫以金属片或将针头锤扁，以使金属面密合。针头插入皮下是时勿过深，以兔插入肌肉时，肌肉颤动易造成干扰。如用平板电极，则需先剪毛或用硫化钡、硫经碱脱毛，并涂以导电膏或盐水。电极安放顺序为红-右前肢，黄一左前肢，绿一左后肢，黑一右后肢，白—胸前。根据实验要求，胸前可放一个或几个电极。导联选择取决于实验需要，一般为从心电图记录心率或记录心律失常发生可选肢导联任何一个有P波、R波及T波直立的导联。如Ⅱ、aVF，或选胸前反映左。由于胸前导联的电极离心脏近，电压高，波形明显。家兔以上的较大动物按人的心电图记录定标和纸速即可，即1mV=10mm，纸速25mm/秒。大白鼠等较小动物电压较低，为使记录清晰，电压定标可放大为1mV=15或（20）mm，又因小动物的心率快，当超过150～200次/分时，用25mm/秒，纸速记录波形重叠，不便分析，可加快纸速为50mm/秒，图形更为清楚。

动物体位，麻醉影响心电图外，还应注意季节温度，豚鼠T_Ⅱ和T_avI在冬季自发倒置者比春季要少得多。冷血动物的心脏活动与季节温度关系密切，低温下蟾蜍心率可减少为每分钟10次以下，T波可消失，高温时心率可超过100次/分，T波也增高。小动物心电图受呼吸影响较大，基线可随呼吸上下摆动。狗的P波在Ⅲ导联吸气时直立，呼气时可倒置。

动物的体重越轻、年龄越幼小者有心率越快的倾向；鸟类一般较快，而冷血动物较慢；小鼠、大鼠、豚鼠等小动物心率很快，兔、猫等次之，狗、猴等略慢些，但也比人快很多。各种温血动物和冷血动物的心率和心电图正常值可见表12-27至表12-30。在分析动物心电图时供参考。

（四）抗心肌缺氧缺血药

脑垂体后叶素能使冠状动脉痉挛，造成急性心肌供血不足；加以外周阻力增加，导致心脏负荷加重，在心电图上可见到心肌缺血变化。药物若能防治这种心肌缺血变化，被认为可能有抗心肌缺血的价值。此法记录的心电图具有心肌缺血的特异性。常选用家兔，从耳缘静脉注射脑垂体后叶素2.5μ/kg（用生理盐水稀释为3ml），时间30秒。由于静脉推注引起的心肌缺血心电图变化急剧，不便判断药物，可改用静脉滴注法，即在10分钟时恒速滴入上述量的脑垂体后叶素。因家兔心电图变化持续时间较长，心电图记录持续到15～30分钟。静滴可持续更久。滴注后家兔心电图可现出T波先升高缓低平、双相、倒置，ST段抬高，心率变慢，P-R及Q-T间期延长，还偶有窦性心律失常、室性早搏、室性心动过速等心律失常变化。

异丙肾上腺素为强的β受体兴奋药，能通过加快心率增强心肌收缩力等环节增加心肌耗氧量，造成心脏负荷过重，心肌微循环障碍，连续应用可形成心肌梗塞样变化，用心电图和病理切片可检测病变程序。常选用豚鼠、家兔或狗，豚鼠和狗每天皮下注射异丙肾上腺素2～8mg/kg，家兔10～16mg/kg，连续两天。可见心电图T波由正变负或双相，并伴有ST段抬高；窦性心动过速，早搏或其它心律失常。豚鼠心脏病理变化有：白细胞和巨噬细胞浸润，心肌纤维肿胀、断裂、横纹消失，甚至溶解，发生玻璃样变和脂肪变性等。

结扎豚鼠、家兔、猫、狗、猴、猪等动物在左冠状动脉前支均可引起心肌梗塞。其中选用家兔和狗最多且效果明显。

心肺灌流是分析药物对心脏作用的经典方法。一般用狗或猫，但用小动物有其优点，研究强心甙心可采用豚鼠；而研究心肌耐缺氧，则宜选用大白鼠。在大白鼠心肺灌流标本上，可研究心肌耐缺氧能力，还可同时分析心输出量、血压、心率等因素与心肌耐缺氧能力的关系。常选用雄性、体重250～300克左右大白鼠为宜。体重过小或过大，影响耐缺氧时间。大白鼠心肺灌流，最麻烦是出现肺水肿，影响心脏存活时间及实验结果。减轻心脏前负荷可以缓和肺水肿的产生。

饶曼人等报导在白鼠对强心甙的作用虽较猫敏感性低671倍，但研究一般药物对心脏收缩力、心输出量、静脉压的影响，较狗、猫心肺制备节省大量人力、物力。采用大白鼠心肺灌流法用以研究心肌耐缺氧能力，较小白鼠在密闭容器内观察常压或减压时的死亡时间，能更准确地代表心脏耐缺氧能力，而且能测定药物对心输出量、血压、心率、心收缩力等功能的影响，有利于分析药物延长耐缺氧时间的影响因素。但实验条件、技术操作都有一定要求，动物用量及工作量也较大，作为筛选药欠简便，作为分析抗心绞痛药物的作用原理，则较为合适。

强心甙生物检定，常选用健康体重260～380克家鸽、1.5～4公斤猫、200～600克豚鼠和体重相差不超过7%的蛙作实验。

（五）血管阻力测定

器官或局部血管恒速灌流泵法：根据血管阻力（R）与灌流压（P）成正比，与流量（Q）成反比的原理，可以用各种流量计测定血流量，并且同步记录动脉血压（即灌注压），用上述原理即可推算出血管阻力，常选用体重12公斤以上的狗作实验，可采用内颈动脉灌流法、椎动脉灌流法、后肢血管灌流法、肾动脉灌流法等测定血管阻力。还可选用体重250克以上的大白鼠，采用后肢及肾动脉灌流法来测定血管阻力。大白鼠腹主动脉与下腔静脉紧贴在一起，分离腹主动脉时，不要弄破下静脉造成出血；插入腹主动脉灌流用的塑料管位置要适当，以保持后肢灌流通畅，如有扭曲，血管阻力急剧升高，造成人为误差。塑料插近可拉成葫芦形，以便结扎固定于腹主动脉内；为使血压稳定，可输注适量6%小分子右旋糖酐。大白鼠血压和血管阻力对药物反应敏感，且大白鼠消耗药量少，又节约人力，最适合于筛选新药和研究心血管药理。但大白鼠血压和阻力记录有时不及狗稳定，对某些药物反应的特异性及动物种属的差异还有待积累资料。

药物对血管的作用，除了在整体动物身上观察分析其作用外，还可在离体情况下进行。其原理都是使动物的器官与身体血液循环隔断联系，人工地用适当的溶液（如洛氏液）从动脉近心端灌入，并以一定压力使灌流液经组织毛细血管至静脉流出，以维持器官的生理功能，从灌流液的流量可反应该器官的血管阻力变化情况。常选用兔耳、下肢、肝、肾、肠系膜血管灌流。带神经离体兔耳血管灌流法用于分析舒约缩血管的作用部位。药物注射于躯体或另一兔耳，如能增加或减少带神经的兔耳灌流量，说明是间接作用，如药物直接注入带神经的兔耳上才发生反应，则是直接作用。离体兔耳血管灌流法用以观察分析舒缩血管药物对兔耳血管的直接作用。离体兔耳血管因无中枢控制，血管张力降低，对收缩血管药敏感；对扩张血管药敏感性稍低，灌流压应根据流量酌情调节。

大白鼠离体膈肢交叉灌流法，从甲鼠的颈动脉引出血液，灌注到受血动物乙鼠的离体后肢，通过接受器和泵使灌注血回到甲鼠颈静脉。在该制备中，利用乙离离体后肢只保留神经与其它部分联系，故药物只能通过神经影响后肢；而给予甲鼠的药物，则只通过血流来影响所灌注的后肢血管；以此来观察分析药物是直接作用还是通过神经起作用。还可采用大白鼠离体后肢灌流法和大白鼠离体后肢自身灌流法进行实验。大白鼠肾脏灌流实验法可用于研究肾血管阻力等血液动力学变化及肾脏重吸收、分泌等生理生化功能。

四、消化系统药理实验中的选择与应用

（一）消化系统分泌实验

1．胃液分泌实验　胃液收集常选用狗和大白鼠。由狗右侧嘴角插入胃管收集胃液，大白鼠则需剖腹，从幽门端向胃内插入一直径约3mm的塑料管，在紧靠幽门处结扎固定，以收集胃液，可进行胃酸的测定和胃蛋白酶的测定。

2．胰液分泌实验　胰液收集可选用狗、兔或大白鼠。在全麻下进行手术，狗在主胰管开口十二指肠降部，距幽门12cm左右处，要将十二指肠翻转，在其背面即可找到。兔的胰腺很分散，胰管位于十二指肠的升段，距离幽门约17cm左右处。分别向主胰管内插入细导管收集胰液。大白鼠的胰管与胆管汇集于一个总管，在其入肠处插管固定，并在近肝门处结扎和另行插管，就可分别收集到胆汁和胰液。大白鼠的胰液很少，插入内径约0.5mm的透明导管后，以胰液充盈的长度作为观察胰液分泌的指标。慢性实验时可选用狗作胰瘘手术后收集胰液。

3．胆汁分泌实验为了观察某些药物对泌胆、排胆以及存在于胆系内结石的影响，需要研究用药前后胆汁流量及其成分的变化。胆汁可分别给动物作胆囊瘘和总胆管瘘收集。胆囊瘘常选用狗、猫、兔和豚鼠进行，而以狗为佳。在全麻下进行手术，以右肋缘下横切口的暴露最为满意。如欲观察肝胆汁的分泌情况需要结扎胆囊管或选用大鼠，因后者无胆囊，所以作总胆管造瘘手术常选用大白鼠。收集胆汁后可进行各种胆汁的化学分析。

（二）消化系统运动实验

1．动物离体标本实验消化道平滑肌具有肌源性运动的特点，动物离体的肠段、胆囊、乃至胃肠肌片，只要具有合适的存活环境就可保持其运动机能。这是药理学研究中常用的一种离体实验方法，这具有实验条件较易控制、操作较简单、用一般仪器设备即能工作等优点，从而应用较广。

标本制备大都选用兔、豚鼠、大白鼠等动物的组织，也可利用手术中取下或猝死剖检时取下的消化道器官进行实验。

取禁食24小时的动物，通常用击头致毙法处死，以避免麻醉或失血等对胃肠运动机能的影响。立即常规剖腹，取出所需的胃、肠、胆囊等，去除附着的系膜或脂肪等组织。迅速放在充氧（或含5%CO₂）、保温（37℃）的保温液中，并以注射器用保温液将管腔内的食物残渣洗净。操作时动作要轻柔，冲洗时不宜采取高压以免疫组织挛缩。

若以肌片为标本，一般剪取1～5mm宽，1～2cm长的一段即可。若用动物的肠管做实验时，通常取十二肠或回肠。十二指肠的兴奋性、切律性较高，呈现活跃的舒缩运动。回肠运动比较静息，其运动曲线的基线比较稳定。所用的标本大都取1.5cm左右一段即可。以狗的胆囊做实验时可截取4mm宽，2cm长的全层肌片。兔、豚鼠等的胆囊较小，取材时常与胆管一起摘下。兔的胆囊可沿其长轴一剖为二，豚鼠则可以整个胆囊或取其半进行实验。做胆管的离体实验量，通常取狗的总胆管，将相联的十二指肠组织切除，留下乳头以及胆道末端括约肌组织。

离体胃、肠运动的电活动，除了峰形电位外还可记录到周期性的慢波。它们在胃肠道的不同部位以及不同种属的动物间存在一定差异（见表10-32）。

表10-32　离体胃肠组织的慢波频率（次/分）

组　织	人	狗	猫
胃	3	5	4
十二脂肠	12	18	18
空　肠	10	17	16
回　肠	8	10	12

2．消化器官运动在体实验　利用整体动物观察消化道动物的方法很多，诸如肠管悬吊法、内压侧定法、生物电记录法、腹窗直视法以及X线检查等等。这皯方法各有所长，也各有其不足之处，在进行药理研究时可以酌情选用。

常选用狗、猫或兔，择其健康成年者，性别不构。由于巴比妥麻醉剂对消化道运动有抑制作用，故有些作者用猫或兔做实验时，愿意用乌拉坦1.0～1.5g／kg静脉或腹腔注射进行麻醉。观察胆道系统的运动则以母狗为佳，因为肋弓角较大容易暴露。在禁食12～24小时后进行实验。

进行胆道口括约肌部胆道内压测定实验时，大都选用狗或猫，也可用兔。狗的胆道位置较深，要求良好的手术暴露。猫的总胆管相对地较粗，操作也较容易，但手术耐受性稍逊于狗。兔的总胆管容易瓣认，壶腹部明显地呈现于十二指肠第1段的表面，但组织纤维，操作时务必仔细。狗的总胆管粗约2～3mm，位于十二指肠降部、循小网膜右缘而下，在下腔静脉之前、门脉之右。

（三）催吐、镇吐、厌食实验

1．催吐和镇吐实验常选用狗和猫做实验。给狗皮下注射盐酸阿朴吗啡1mg/kg；注后2～3分钟就可以引起恶性呕吐。用1%硫酸铜或硫酸亚铅溶液50ml给狗灌胃，约2～3分钟后也可引起呕吐，但几乎无恶性现象。

2．厌食实验　这是防治肥胖病及其并发症的研究内容之一。可以选用狗、猫、大鼠、小鼠等进行实验，猴因有颊囊，且有精神因素参与，故选用者不多。狗容易呕吐，也有行为因素，故也不理想。一般多选用大白鼠。

（四）消化系统常见病动物模型

1．胃病　急性胃炎的实验模型常选用大白鼠。实验前禁食24小时，以水杨酸制剂（如20ml的阿司匹林或水杨酸溶液）按100mg/kg给药，或以10ml的醋酸或不同浓度的盐酸（1、10、100ml），或同种动物胆汁、2ml的牛磺胆酸、15%的乙醇等单独或几种合用灌胃，4小时后动物胃内发急性弥慢性炎症变化。

慢性胃炎的实验模型常选用慢性胃瘘狗，每日经瘘灌70～75℃的热水300ml，连续60天后可引胃粘膜萎缩，胃酸减少甚至缺失。还可用同种或自身的胃液（按4～5ml/kg取胃液，并浓缩50倍），或胃粘膜的生理盐水的组织匀浆与Freund佐剂以1：1配成乳剂，皮下注射进行免疫，隔15～30天再注射一次，即可诱发致胃粘膜发生细胞浸润及萎缩性病变。

急性胃溃疡的实验模型常选用200～250g的成年大白鼠，用浸水刺激造成应激性溃疡。

结扎大白鼠幽门可诱发成胃溃疡，其成功率与动物禁食情况以及结扎后经历的时间等有关。一般诱发成功率达85～100分，是最常用的模型之一。

组织胺法常选用雄性白色豚鼠，禁食18～24小时，全麻下找出十二指肠，在十二脂肠的胆管开口上方夹一动脉夹造成狭窄，以使胃液潴留并防止十二脂液返流入胃。皮下注射磷酸组织胺水溶液（2.5～7.5mg/kg，根据动物品种而剂量不同），1小时后即可恒定地复制出胃溃疡。

慢性胃溃疡的实验模型常选用大白鼠。可用热烙法或醋酸浸溃造成胃壁损伤形成溃疡。热烙法是在无菌剖腹后，以3mm粗的15W电烙铁加热至45℃左右，灼烙腺胃约5秒种后粘膜出现水肿，6小时后有明显出血。醋酸浸溃法可用10%或20%醋酸溶液0.05ml，用0.01ml刻度的结核菌素注射器利用26号皮内针头作胃壁粘膜注射或以棉签蘸100％醋酸溶液通过内径5mm的玻璃管涂敷胃浆膜面或剖开胃腔涂于粘膜面引起腐蚀性溃疡。

2．肠病　肠梗阻实验模型常选用狗。在单纯结扎肠管24小时后，即可见梗阻以上肠段明显扩张。也可采取结扎肠系膜血管、人工造成肠套或肠扭转等方法复制。

肠粘膜实验模型通常选用狗，不能选草食动物，因其阑尾无论在结构或机能上均与人的阑尾有较大差别。狗虽也差别，但狗的阑尾粗而长，容易处理。

溃疡性结肠炎实验模型可以选用大白鼠，通过免疫方法制备。一般是用同种或异种动物的结肠粘膜匀浆加Freund佐剂，给大白鼠足跖肉垫内注射，约10天后随着血清抗结肠粘膜抗体滴度的升高和便血，在盲肠与结肠出现溃疡性结肠炎变化。也可给兔结肠浆膜下反复多次注射卵白蛋白或向兔的上肠系膜动脉内注射内毒素均可造成溃疡性结肠炎变化。

3．腹膜炎　细菌性腹膜炎是以生理盐水稀释肉汤培养的大肠杆菌液，制成1×108/ml菌量的悬液，给豚鼠腹腔注射可以规律性地引起严重的腹膜炎，大都在24～48小时内死亡。若菌量小，毒力低，有进就不易造成实验性腹膜炎，用大鼠和小鼠做实验时尤其如此。

4．胰腺炎　急性胰腺炎实验模型大都选用雄狗，且以体重在15公斤以上者为佳。较小的狗狗胰管细，雌狗脂肪多，均可影响手术操作。在无菌操作下，分离出主胰管。若在结扎主胰管的同时，饲以高蛋白、高脂肪食物，或注射促胰激素使胰液分泌增加，可以诱发一过性的胰腺水肿，如果在结扎胰管的同时暂时阻断胰动脉或以有活性的胰蛋白酶作动脉内注射则可导致现血性胰腺炎。

慢性胰腺炎实验模型常选用大白鼠或豚鼠，以含0.5％量的dl-乙硫氨酸饲料喂养动物1～2个月；或每日用该药250mg作腹腔注射，连续10天即可引起胰腺泡破坏和炎细胞浸润。也可选用大白鼠，用20％乙醇置于滴瓶中代替饮水，让动物自由吮吸，持续8个月以上，即可使胰腺细胞内出现脂肪滴，线粒体和胞浆呈退行性变。若饮用20～30个月则可出现腺泡萎缩、腺管上皮增殖，小叶内有散在结缔组织增生以及腺管内出现蛋白栓等变化。

5．胆结石　使动物胆道发生感染，胆汁淤积，胆固醇代谢发生障碍等均可使动物胆道形成胆石。复制胆石模型的方法很多，食饵法，常选用叙利亚地鼠，体重60g左右，喂高糖、不含非饱和脂肪酸饲料（蔗糖74%、酪蛋白21%、食盐4.4%、胆碱0.1%、浓缩鱼肝油0.5%），每只地鼠5～9g/次，每天2次，14～21天胆囊内形成明显结石，22天后成石率高达100%。也有选用健康雌性豚鼠，饲鼠基础食料中加入酪蛋白1%、蔗糖1.5%、猪油1%、纤维素1%、胆酸0.02%、胆固醇0.05%的成石饲料，2个月后在90%的豚鼠胆囊中产生了以胆色素为主的结石，其成份和结构与人类的胆色素结石相似。

感染成石法常选用健康成年家兔、大白鼠成狗。采用无菌手术，暴露家兔十二指肠，从十二指肠乳头插入塑料管，由此管注入蛔虫卵或大肠杆菌，同时还可从此管抽取胆汁进行细菌培养和分析。注入蛔虫卵后7个月，胆囊内可形成结石。狭窄成石法常选用健康成年家兔、狗或猴，但家兔的诱发率高。无菌手术探明胆道及胆囊正常，用银夹适当地夹住兔胆囊颈部，以产生部分梗阻。结果6个月后家兔胆囊中有明显结石形成。

切除迷走神经干成石法常选用成年狗或兔。采用无菌手术探明家兔胆道及胆囊正常，然后暴露胃、贲门及食管，将食管悬吊，暴露两侧迷走神经干，分离后从食管下端切除两侧迷走神经干各1.5～2cm，手术后4～5周有胆固醇结石形成。

异物植入成石法常选用成年健康狗或兔。动物麻醉后，在无菌操作下暴露胆囊，在胆囊底部剪一小口，植入蛔虫碎片或人胆石、线结、橡皮等，用小圆针荷包缝合剪口，植入2～3月后胆囊内可见到多数黑色细砂，植入的异物可被墨绿色的胆石成份所包裹，若植入数个异物则有时可以被粘结成一个大的团块。

五、呼吸系统药理实验中的选择与应用

（一）镇咳药的筛选实验

豚鼠对化学刺激物或机械刺激都很敏感，刺激后能诱发咳嗽；刺激其喉上神经亦能引起咳嗽，加之一般实验室较易得到，因此，豚鼠是筛选镇咳药最常用的动物。猫的生理条件下很少咳嗽，但受机械刺激或化学刺激后易诱发咳嗽，而猫较豚鼠难得，故猫选用于刺激喉上神经诱发咳嗽，在初筛的基础上，进一步肯定药物的镇咳作用。狗不论在清醒或麻醉条件下，化学、机械，电等刺激胸膜、气管粘膜或颈部迷走神经均能诱发咳嗽；狗对反复应用化学刺激所引起的咳嗽反应较其他动物变异少，故特别适用于观察药物的镇咳作用及持续时间。但狗从经济上和来源上较豚鼠和猫都昂贵、困难，只能用于进一步肯定药物的镇咳作用。

兔对化学刺激或电刺激不敏感，刺激后诱发喷嚏的机会较咳嗽为多，故兔很少用于筛选镇咳药。小白鼠和大白鼠用化学刺激虽能诱发咳嗽，但喷嚏和咳嗽动作很难区别，变异较大，特别是反复刺激时变异更大，实验可靠性较差。根据国内有关单位的经验，认为小白鼠作为初筛镇咳药的动物是可取的。

（二）呼吸道平滑肌实验

离体气管法是常用的筛选平端药的实验方法之一。常用的实验动物中，豚鼠的气管对药物的反应较其它动物的反应更敏感，且更接近于人的支气管，因此豚鼠的气管可作为常用的标本（表10-33）。

表10-33　不同动物的气管敏感性（g/ml）　

收缩剂	豚鼠	人	狗	猫	兔	大白鼠
乙酰胆碱	10-7	10-5	10-9	10-8	10-6	10-6
组　织　胺	10-7	10-5	10-6	-	-	-

注：①狗的气管对乙酰胆碱极度敏感（10^-9）。

②猫、兔和大白鼠的气管对组织胺不敏感。

肺支气管灌流法是测定支气管肌张力的研究方法之一，方法简便、可靠，所得的结果反映全部气管平滑肌张力情况。常选用豚鼠和兔，也可用小白鼠。

药物引喘实验常选用豚鼠，不少药物以气雾法给予豚鼠可引起支气管痉挛、窒息，从而导致抽搐而跌倒。这种动物模型可用于观察药物的支气管平滑肌松弛作用。目前最常用的引喘药物是组织胺和乙酰刞硷。实验时豚鼠必须适用幼鼠，体重不超过200g，并引喘潜伏期不超过120秒。

六、泌尿系统药理实验中的选择与应用

（一）利尿药及肾功能测定实验中动物的选择应用

1．利尿药及抗利尿药筛选实验：要判断所试药物是否有利尿作用，可选用大白鼠、小白鼠、猫或狗进行实验，其中以大白鼠较为常用。对人体有利尿作用的药物均可在大白鼠实验中获得较好的利尿效果，但汞撒利的作用较差。因此筛选利尿药实验的首选动物虽多采用大白鼠，必要时还应再选用另一种动物实验，加以验证。

收集动物尿液的方法可分为两大类：一是用代谢笼收集较小动物24小时以内的尿液量，称为“代谢笼实验法”，适用于大白鼠及小白鼠。为了防止尿液的蒸发和粪便的污染，可选用特别的集尿装置或用滤纸吸导尿液加以称重，用此类方法时，实验环境（气温和湿度）的影响较大，应予控制，室温以20℃左右为宜。二是直接自输尿管或膀胱收集尿滴，适用于猫、狗、家兔和大白鼠，实验可在较短时间内完成，受外界环境影响也较少，但动物处于麻醉状态下，与清醒动物还有区别。欲进行清醒动物的利尿实验，可采用膀胱瘘法，即预选给狗或猫进行膀胱瘘手术，二周后切口愈合，再将动物固定于特制支架上收集尿液进行实验。在利尿药筛选实验中，家兔不是首选动物，但因其价廉易得，某些初筛实验也可用家兔代替家犬进行直接集尿的实验．过去曾用膀胱套管法，由膀胱做切口插入套管，再做荷包缝合，但方法复杂，套管内的尿液往往不能顺利流出，不如用聚乙烯塑料套管直接插入输尿管为好。常选用2kg以上健康雄性家兔作实验。

2．肾清除率测定实验：肾清除率是检查肾功能的一项重要方法。它表示肾脏对血液里某物质的清除能力，还可以了解肾血流量，游离水的生成和重吸收等方面的情况。狗和大鼠均可用来作清除率试验。大鼠较易获得，较易饲养，成本低，实验时药品消耗少，在急性实验时较易在清醒状态下作清除率测定。

菊糠清除率实验常选用大白鼠进行。清除率是指每毫升血浆“清除”物质的比例。血浆里物质大多能被肾小球滤过，又能被肾小管细胞分泌或重吸收。唯独菊糖仅被肾小球滤过，而不被肾小管细胞分泌重吸收，故它的清除率就是肾小球滤过率。

游离水清除率实验常选用健康成年狗进行，游离水清除率实验，是一种测定尿中游离水生成的方法。利用这种方法可以衡量肾脏对尿液浓缩和稀释的能力，分析利尿药对尿浓缩和稀释机制的影响，从而推测利尿药的作用部位。

对氨基马尿酸清除率实验常选用大白鼠或狗，但以大白鼠更为常用。对氨基马尿酸的清除率可作为有将肾血浆流量的客观指标。

3．截流分析实验：截流分析实验常选用10kg以上健康狗做实验。截流技术系一种分析肾小管各段运转功能的方法，利用这种方法可对利尿药作用部位进行初步分析。

4．肾小管微穿刺实验：肾小管微穿刺（Micropuncture）技术，于1941年开始应用于哺乳动物肾脏研究，近年来更获得很大进展，发展了微量注射，微量灌流等技术，对离子及其他物质在肾小管的不同节段中的转动过程，作了精确的阐明；用于利尿剂的研究，则可探测对单个肾单位功能的影响以及药物的作用部位。该实验常选用大白鼠或狗进行。如欲穿刺集合管，可用幼年大白鼠或金地鼠；如欲穿刺肾小球，常用Munich-Wistar大白鼠，因其肾小球位置表浅，易于穿刺。大鼠体重一般采用200～250g较好。

（二）泌尿系统疾病的动物模型

1．肾炎

⑴肾小球肾炎：Masugi型肾炎动物模型是选用羊抗兔肾血清引起兔或大白鼠的肾小球肾炎。羊抗兔血清制备是选用体重2kg左右健康兔处死后取出肾脏，插入导管，反复用生理盐水冲洗，然后将皮质与髓质分开，用肾皮质5g研成匀浆与弗氏完全佐剂混匀成10ml，再加生理盐水使总量达30ml。此混悬液给绵羊皮下或肌肉多处注射共4次，每2周1次，于末次注射后2周采羊血分离出血清，用等量兔红细胞吸附，置于4℃一整夜以吸去血清中可能存在的抗兔血细胞抗体，经离心，取上清液置于56℃水浴中半小时灭活。通过上述处理的血清给健康兔静脉注射，每次0.5～2.0ml，隔半小时一次，约连续注射3～5次出现蛋白尿为标志，可认为已形成了严重的肾小球肾炎。

⑵慢性肾小球肾炎：动物模型是用异种动物（兔、大白鼠、狗）肾小球基底膜和弗氏佐剂，给绵羊或猕猴注射，可复制成慢性肾小球肾炎。猕猴以选用2.2～4,5kg体重的健康猴较好。

⑶异种蛋白引起的肾炎：可先由静脉注入异种蛋白以使动物致敏，然后将蛋白直接从动脉作决定性注射，以引起急性肾炎。兔耳静脉注入不稀释的鸡蛋白1～6ml，每次间隔4～5天，共注射4～5次，末次致敏注射后6～12天手术，在无菌条件下，打开腹腔分离出肾动脉，经由套在注射器上特殊玻璃小管，向一侧或两侧注入不稀释的鸡蛋白1～3ml，作为决定性的攻击。在注入蛋白后，用手指压迫和用线结扎肾动脉约5～6分钟。经上述处理的动物大多数皆能造成典型的肾炎病变。给狗腹腔注射马血清，每次5ml，6天1次，共注射13次，于第14次向肾动脉注入5ml马血清也可引起实验性肾炎。本法造成的肾炎病变，与人类肾炎的病理改变很相似。

⑷ECHO9病毒引起肾小球肾炎：选用出生6天的HAM/ICR系小鼠，每只用含ECHO9病毒的肾组织培养液0.1ml腹腔注射，注射6天后，幼鼠肾组织学改变类似于急性肾小球肾炎。肾小球细胞增生，肾小管内有透明管型。注射2～3周，幼鼠肾小球损害可达高峰，6周后减轻甚至消失。

2．自身免疫肾小管间质性肾炎

肾脏含有特殊的抗原，它仅存在于小肾皮质。用兔肾皮质中肾小管的基底膜与弗氏完全佐剂免疫豚鼠，可造成自身免疫肾小管间质肾炎。在无菌条件下，取出新西兰兔的肾脏，用等渗的氯化钠溶液灌注，置于－25℃冰箱中过夜,而后取出缓慢地融化。去掉肾髓质部分，将皮质捣碎，通过150目金属筛后，盛于冷容器中，先用盐水清洗，接着用pH7.1的磷酸缓冲液反复清洗，再经过1500转/分离心5分钟。因肾小球较肾小管沉淀得快，经显微镜证实，弃去细胞残渣，将含有丰富肾小管的上层液与弗氏完全佐剂制成肾小管基底膜的乳化剂（TBM乳剂），这种制剂中含有肾小管约90%和少量肾小球。每毫升含和TBM湿重15mg。选用体重400～500g的雄性豚鼠，每2周在背部皮肤分别选6个点作皮下注射，每点注乳剂0.1ml。经32天后处死动物。可见肾脏肿胀，表面有小瘀斑。组织学检查可见有典型的间质性肾性病变。

3．肾病

（1）升汞中毒性肾病：用不同浓度的升汞溶液给狗、家兔和大白鼠皮下或肌肉注射，可造成基本病变相似的坏死性肾病。给实验前造成输尿管瘘或膀胱瘘的狗。用2%升汞溶液按20mg/kg的剂量由腹部皮下注射。1～2小时后，尿量急剧增多，为原来的5～10倍，比重由1.007降至1.001。数小时后，尿量开始下降，第二天发展为少尿或无尿，比重增高1.045～1.049，有少量蛋白。家兔用1%升汞溶液皮下注射，每次0.75～0.80ml，每天1次，5天可致肾病发生。大白鼠、小白鼠按6～15mg/kg的剂量皮下注射。小白鼠对升汞敏感性个体差异大，但也能发生明显的坏死性肾病。适用体重190～250g大白鼠按12mg/kg的升汞剂量肌肉注射。24小时内动物肾功能受损，肾小球滤过率进行性减少，近曲小管水的重吸收减少以及管内压降低，尿量可少于3ml/24小时。

（2）藏红花红O造成的肾病：选用家兔作实验。用加热37℃的任-洛氏液配制成1%藏红花红O溶液，由兔耳缘静脉注入，总量为30mg，分2次注入，间隔3小时。注后24小时动物血清尿素氮显著增高，血清钾、钠也升高，伴有不同程度代谢性酸中毒。藏红花红O可选择性地引起近端和远端明曲管上皮广泛坏死，造成的模型与临床表现较一致，故在国内较为常用。

3．肾结石、膀胱结石

在动物身上复制泌尿系统的结石是比较困难的，也不能复制人体结石形成的全部复杂过程。一般是以异物移植入膀胱内，也有用维生素A的食物饲养动物或清注细菌等方法造成。有文献报导，用乙二醇（Ethylene　Glycol）和乙醛酸钠（Sodium　Glyoxylate）中毒时，在肾内形成草酸钙结晶，有利于结石的发生。

（1）植入异物造成膀胱结石：选用大白鼠，无菌手术切开膀胱，植入异物后缝合，术后加强护理，经4～10周后，多数动物可形成结石。异物可选用石腊、人的泌尿道结石碎块、铅、锌、磷等，使其大小不得超过3～4mm直径，金属异物应是均匀一致的圆形物，平均重叠约2.5mg。

（2）食饵性的泌尿系结石：选用大白鼠（也可用小白鼠、豚鼠或家兔）饲喂维生素A缺乏的食物而引起。最好选用出生一个月左右的幼年雄性大白鼠（雄性动物体内维生素较雌性少，且生长较快），每3天称重1次，用维生素A缺乏的食物饲养，经过10～14天后动物体重下降，生长停滞，有干眼病表现。在30～60天中14%动物发生了膀胱结石，经180～250天后，膀胱结石发生率可达88%，肾结石为41%。

第六节　口腔医学研究中实验动物的选择与应用

一、常用实验动物口腔解剖生理特点

口腔医学和医学其它科学一样正在飞速发展。新的治疗方法、药物、矫形材料等的不断发现，有些可以直接用于临床，有些必须通过动物验证验证后才能应用于临床。因而，实验动物在口腔医学研究中的地位就显得愈来愈重要了。可以选用实验动物进行口腔器官先天畸形、缺损、后天创伤、炎症及肿瘤的研究等。如龋或非龋性的牙体病、牙髓病、尖周病、牙周病、口腔粘膜病、肿瘤以及涎腺、关节、颌骨疾患和错畸形等的病因、病理、病程、诊断、预防及治疗（含镶、补技术）方法的研究等。在选择实验动物进行口腔医学各种研究时首先必然熟悉这些实验动物口腔的解剖、生理特点。

（一）常用实验动物牙齿数目和生长特点

1．齿式和数目（以恒牙为标准）

猴　2（2123/2123）=32狗　2（3142/3143）=42；

猫　2（3131/3121）=30兔　2（2033/1033）=28；

豚鼠　2（1013/1013）=20地鼠　2（1003/1003）=16；

大鼠　2（1003/1003）=16；小鼠　2（1003/1003）=16。

常用实验动物牙齿数目见表10-34

表10-34　人和常用实验动物的恒牙数目

人和动物	门（切）齿	尖（犬）齿	前臼齿	臼齿	恒牙数
人	8	4	8	12	32
猴	8	4	8	12	32
狗	12	4	16	10	42
猫	12	4	10	4	30
兔	6	0	10	12	28
豚　鼠	4	0	4	12	20
地　鼠	4	0	0	12	16
大　鼠	4	0	0	12	16
小　鼠	4	0	0	12	16

2．牙齿生长特点猴的牙齿生长与脱落有一定规律。新生仔猴一般无齿，偶而长出二个门齿。6个月内乳齿20个出齐，中间生长停止到14～16个月。然后开始生长恒龄换乳齿。恒河猴牙齿生长次序为，乳齿：下中门→上中门→下侧门→上侧门→上犬→下犬→上前臼2→下前臼2→下前臼3→上前臼3；恒齿；下臼1→上臼1→上中门或上侧门（换）→下中门（换）→上侧门（换）→下侧门（换）→上臼2→下臼2→前臼1（换）→前臼2（换）→犬换→臼3。

恒河猴年龄与牙齿生长情况见表10-35

表10-35　恒河猴牙齿生长情况

年龄（月）	牙　齿　生　长　情　况
出生	新生仔猴一般无齿，少数偶尔长出二个门牙
1.0	四个中门齿于上下颌同时生长
1.5	生长快36天就可长8个门齿
2.0	上颌犬齿刚冒尖
3.0	上颌犬齿，第一前臼齿同时冒尖
4.0	上下颌第一前臼齿长出
4.5	下颌第二前臼齿冒尖或第1前臼龄全部长出
5～6	乳齿全部长齐
14～16	下颌右侧第一臼齿先长，下颌左侧第1臼齿后长
17～18	第一臼齿生长，情况各不相同
19～31	上、下颌第一臼齿长全
32～40	换中门齿、侧门齿，次序变化大。换犬齿，并长出第二臼齿
42～43	换下颌侧门齿、中门齿。第二臼齿全部长出，换第一前臼齿
44～56	换第二前臼齿，换犬齿
65～78	下颌第三臼齿长出
72～82	上颌第三臼齿长出，至此全部恒齿长齐

狗有恒齿42枚，切齿自第1至第3逐渐增大，下切齿比上切齿小。犬齿发达，大而尖锐呈弯形。臼齿的数目也因品种而异，一般的齿式为6/7，但在短头型狗的臼齿常为5/7臼齿的大小也有很大差别，其中以上臼齿的第4齿和下臼齿的第1齿最大，其前后各齿均逐渐变小。仔狗生后十几天即生出乳齿，两个月以后开始由门齿、犬齿、臼齿逐渐换为恒齿，8～10个月齿换齐，但犬齿需要1岁半以后才能生长坚实。狗的年龄与牙齿生长、更换和磨损情况见表10-36。

表10-36　狗年龄与牙齿情况

年　龄	牙　齿　情　况
2个月以下	仅有乳齿（白、细、尖锐）
2～4个月	更换门齿
4～6个月	更换犬齿（白、牙尖圆钝）
6～10个月	更换臼齿
1岁	牙长齐，洁白光亮，门齿有尖突
2岁	下门齿尖突部分磨平
3岁	上下门齿尖突部分都磨平
4～5岁	上下门齿开始磨损呈微斜面并发黄
6～8岁	门齿磨至根，犬齿发黄磨损唇部，胡须发白
10岁以上	门齿磨损，犬齿不齐全，牙根黄，唇边胡须全白

（二）常用实验动物口腔内某些解剖生理特点

狗、猫和其它肉食动物的犬齿特别发达。猫舌上的丝状乳突被有厚的角质层，成倒钩状，便于舐刮骨上的肉。兔是草食动物，门齿发达用以切断草料，没有犬齿，在口腔顶壁硬腭的表面有平滑的粘膜，在粘膜上有很多横褶。绵羊和山羊的上唇感觉敏锐，运动灵活。

狗的唾液腺发达，包括腮腺、颌下腺、舌下腺和眶腺四对。有人认为狗的唾液中不含有淀粉酶，但含有溶菌酶，能杀灭细菌，所以常见狗用舌舐伤口，有清洁消毒作用。由于狗缺乏汗腺，天热时可大量分泌唾液以散热。

猫有五对唾液腺，即耳下腺、颌下腺、舌下腺、臼齿腺和眶下腺，均开口于口腔，组成了混合的分泌物－唾液。

兔的唾液腺很发达，除具有一般哺乳动物所具有的三对唾液腺（腮腺、颌下腺、舌下腺）外，还有一对眶下腺，此外还有一些分散的小腺体。兔的唾液内含有淀粉酶，但分解淀粉能力很弱。

豚鼠有五对唾液腺、腮腺、颌下腺、颧腺、大舌下腺和小舌下腺。此外，唇角附近有唇腺，口腔侧壁的颊内有颊腺。

大鼠和小鼠的唾液腺有三对，即耳下腺、颌下腺和舌下腺。

兔舌的表面有许多乳头，为味觉感受器，舌尖和两侧分布的最为密集。狗舌前部宽而薄，后部较厚，舌的背面中央有纵沟，表面上覆有一层密集的丝状乳突。舌的两侧缘分布有蕈状乳突，在舌背面的后部，除丝状乳突外还有锥状乳突，它们都是味觉感受器。大鼠门齿后面接近中线处有1对小的唾液腺乳头。靠近舌基部有轮廓乳头，舌背有圆锥乳头和丝状乳头。

狗口腔的形状和大小，与其头骨形成有密切关系。长头型的狗口腔长而狭窄，短头型的则口腔短而宽。狗的口裂很大，口角约与第3或4臼齿相对。唇薄而活动灵活，表面长有触毛，上唇中央部有一小区无触毛，而有一中央沟（人中），下唇侧缘有锯齿状突。

二、动物的选择与应用

（一）猕猴和狨猴

猕猴是口腔医学实验研究的首选动物。特别是口腔矫形学和口腔内科学研究更为常用，如用于再植牙的效果观察；组织病理变化；干槽症组织病理变化的研究；以及探讨各种治疗方法、治疗材料组织愈合的影响等，以求得最佳的临床治疗效果。

猕猴的牙齿数目和人类一样，牙齿的排列类似于人类，口腔内存在的许多微生物也相同于人类口腔中存在的微生物，如给猕猴的食物中加大糖的含量喂动物后。可以诱发乳牙恒牙龋齿，发生的龋齿变化类似于人类，故可选用猕猴进行龋齿病因、发病和治疗等方面的研究。

狨猴的牙周组织对一般的代谢改变极为敏感。老年狨猴的牙周膜改变极类似于老年人的牙周膜改变，另外，狨猴牙周炎的发生过程以及组织病理学改变也类似于人类，所以狨猴作为牙周疾病的研究是极为理想的动物。

猕猴也用于牙齿折裂方式、程度以及处理时间、处理方法和组织病理变化的研究，以探讨治疗效果；还常用于补牙材料、镶牙材料对牙髓及牙周组织及骨组织的毒性、致癌性等的研究。

（二）家兔

家兔颈部和颌面部的血管分布类似人类。人类颈面部的手术常需要结扎颈外动脉，对于结扎后产生的一系例问题如：血液循环障碍、血行恢复时间等，可以选用成年家兔结扎单侧的颈外动脉，观察其分布区域的血管象变化，以探讨血管象的恢复和侧枝循环径路的发展情况。

唇裂俗称兔唇，家兔是研究唇裂和腭裂病因（如遗传、药物、环境等）与其它先天缺陷（如脑水肿、脊柱裂、呆小症、软骨发育不良等）关系的极好动物。

兔下颌骨突出已有报导，引起突出的原因与人相似。可以用于下颌骨突出原因（如遗传、咬合不正、肢端肥大症）的研究，以及下颌骨突出措施的探讨，以指导临床。

家兔是观察牙髓Arthus炎症反应的敏感动物。Arthus反应是给已接触过抗原的动物皮内注入同种抗原后，数小时内局部出现水肿、红斑、硬结、坏死等为特征的炎症反应，其反应机理属于Ⅲ型变态反应，临床上常用于检测体内是否有特异性循环抗体。实验选用雄性2.5kg，用O溶血素致敏家兔，直到抗体效价上升，出现Arthus皮肤反应之后，再用同一抗原在切牙髓作局部攻击，此后不同时间取出牙髓，用组织学方法和免疫萤光技术进行观察，光镜检查证实牙髓中存在急性炎症，免疫萤光证实牙髓组织中有免疫复合物，特异萤光主要在血管壁，证实牙髓中存在着Arthus炎症反应，借助此反应，说明机体若通过牙髓再次受到同种抗原的作用，骨髓组织就出现炎症，这种炎症是抗原一抗体局部反应的结果。

家兔的建立口腔粘膜溃疡病的模型动物。口腔粘膜溃疡极为多见，一般认为是由于自身免疫或免疫功能受损所致。抗原选用正常产死婴（死亡时间不超过2～3小时），在无菌条件下采集口腔粘膜，生理盐水冲洗干净后放入0.1MpH7.4的磷酸盐缓冲液中，将粘膜剪碎研磨成组织勾浆，加入等量福氏完全佐剂或不完全佐剂，混匀呈乳状液，家兔脊柱二侧皮内注射该液，其注8～10个点，每隔1周注1次，共4次，第1次0.5ml，第2～4次注1～3ml。第4次注后第3天即开始出现口腔粘膜溃疡，以后反复发生，直到观察到第4个月仍有溃疡出现。

家兔适宜进行碎松质一骨髓移植的实验研究。碎松质骨一骨髓（Particulate　Cancellous　Bone　and　Marrow,PCBM）移植术是用髂嵴挖取的碎松质骨，内骨膜及骨髓等成分作移植物修复颌面部骨缺损。常选用健康家兔麻醉后右髂嵴切取1.5×0.5cm²髂骨块，并挖取适量PCBM，然后再进行修复术。

家兔还适用于作口腔整形材料的毒性实验。聚四氟乙烯复合材料是颌面外科及整形外科中一种比较理想的、应用范围比较广泛的人工骨材料，既可代替骨，又可代替软骨及软组织。常选大白耳家兔作毒性实验。

家兔也用于口腔粘膜病、牙周病的病因、病理变化的研究，如损伤家兔三叉神经的上颌支或下颌支，可造成家兔唇部的实验性营养性溃疡。也可用于矫形科的实验研究，如垫实验，探讨牙功能调整机制。

（三）狗

狗在口腔医学研究中应用很广泛，如狗2、3、4前磨牙拔除后，如去除根间骨隔，颇似人类的拔牙创，用于干糟症动物模型的研究。拔除狗牙时，具牙周韧带坚韧，牙髓腔较大，往往牙齿折断或牙槽骨折，牙周韧带仍不易断离，拔牙时应先以细窄蛾眉凿沿牙周反复增隙，尽可能凿断牙周韧带，然后以窄牙挻将牙齿挻松，最后以牙钳夹紧牙齿，顺牙长轴方向以锤叩击牙钳，将牙冲出，如以牙钳拔除，往往造成断根，拔牙后一般出血较多，应认真将拔牙窝刮净，以纱卷止血，方可进行以后的实验。

狗的牙周膜的组织学、牙周炎的组织病理学以及牙周病的流行病因与人的相类似，所以狗作为牙周病动物模型的研究是极为理想的。

在自体牙移植和放射治疗的研究问题上，狗是常用的动物。狗的一些先天性疾病，如唇裂、腭裂、下颌骨突出等，有一定的遗传因素。狗的下颌骨突出的方式相似于人下颌髂突出，所以，狗也可作为颌面部畸形的动物模型研究。

（四）金黄地鼠

金黄地鼠颊囊部涂抹致癌剂二甲基苯并蒽（DMBA），6周后全部动物诱发生成上皮异常增生性白斑，与临床病人口腔粘膜白斑病时病理变化相似，所以金黄地鼠是研究上皮异常增生性白斑较适宜的动物，一般选60g体重金黄地鼠容易成功。

慢性机械损伤烟酒刺激金黄地鼠或大鼠的硬腭后部软腭前部，可成功地诱发出与人类相同的口腔粘膜白斑，所形成的动物粘膜白斑和人类口腔粘膜白斑的临床及病理均基本相似，其恒定期较长，病损在实验期内未恶变，停止刺激后，在短期内也不消退。

金黄地鼠也用于舌癌的研究，1973年Fujita等在采用根管拔髓针搔伤舌体后，再涂抹含有DMBA的丙酮液，经13～25周，使100%的动物产生了舌癌。

（五）大鼠和小鼠

大鼠的切牙基底部迅速增生的上皮和间叶造牙本质细胞对环磷酰胺最为敏感，其靠釉上皮可耐受40mg/kg环磷酰胺的细胞毒作用，可以用此来探讨环磷酰胺细胞毒性对切牙生长的影响。

大鼠腭粘膜下含有大量腭腺，导管开口于粘膜表面，此结构可以作为致癌剂侵入的极好门户。通过手术，把致癌剂植入大鼠下颌骨，可以成功地诱发下颌骨的骨肉癌，作为骨肉癌的动物模型研究。

大鼠舌部涂沫DMBA诱发的白班形成的潜伏短期，比例高，100%的动物能生成白斑，但难以诱发生成上皮异常增生性白斑，而且病变形成后，逐渐消退，可能与大鼠抗病强、口腔内唾液分泌、舌运动对所涂药品有清洁作用等有关。实验的部位不同，其结果也不同。然而，可通过人工方法减少大鼠对所涂药物的清洁作用，提高致癌率，如设计下唇粘膜上皮衬里的人工育袋，再涂上致癌剂，以延长致癌物质对粘膜作用的持续时间，这样可以成功地诱发大鼠口腔粘膜癌。

大鼠是念珠菌性白斑变化的适宜动物。念珠菌感染与某些类型白斑，特别是颗粒型白斑的产生有一定关系。常选用6月龄大鼠，舌背接种白念菌后，舌正常乳头结构消失，白念菌丝侵入正常角化上皮的角质层，并引起增生和炎症改变，上皮逐渐变成或不全角化上皮，最后的外类似人念珠菌性白斑变化，但唇粘膜末出现不全角化层。

小鼠的唇裂和腭裂与人的相似。据报导，其遗传情况也相类似，因此，小鼠非常适合于做唇裂和腭裂的动物模型。

鼠类牙齿的釉质厚度较人齿薄，而且鼠类无制龋的功能，故一旦发生龋齿，其发展较快，损坏严重，所以，在实验分析时需注射这一特性。另外，鼠的门齿是不断生长的，因此，其门齿不适宜于龋齿的研究。

鼠类的品种、品系、年龄不同，对龋齿易感性也不同。如幼年NIH大鼠的敏感性显著低于Sprague-Dawley大鼠；变形链珠菌致小鼠的龋齿变范围远不如地鼠和大鼠，而变形链球菌诱发地鼠的平滑面龋比大鼠更为广泛。随着年龄的增长，鼠类对龋齿变得不敏感，这可能是由于釉质成熟的原因。因此，多数龋齿实验需在动物17～24日龄开始。

不同品系小鼠对牙周病的感受性不同。如STR/N小鼠对牙周病易感，而DBA/2A小鼠对牙周病有抗力。

小鼠和大鼠的唾液腺较为发达，可用来复制唾液腺疾病的动物模型。

巴豆油对单纯疱疹病毒诱发小白鼠唇癌有促进作用，常选用2月龄小鼠进行实验。

Sprague-Dawley大鼠、Charles　River　COBC大鼠、Fisher大鼠、Osborn-Mendel大鼠、Wistar大鼠和金黄地鼠、猕猴、猪等动物的磨牙面有窝沟，解剖形态与人类磨牙相似，若给致病菌丛和致龋食物可以产生肉眼和组织病理方面与人牙一样的龋损，利用这些动物可以建立研究龋齿的动物模型。

第七节　计划生育研究中实验动物的选择和应用

一、常用实验动物的生殖功能、结构特点

实行计划生育是我国的一项基本国策。到本世纪末，力争把我国人中控制在12亿以内，此项任务十分艰巨。如果人口控制不住，就会影响经济振兴，影响现代化，甚至影响社会的安定。广大人民群众迫切需要更多、更安全的、使用方便的节育措施。为了寻找更多的有效措施来控制人类的生育，保证避孕药物或其他节育措施的有效和安全，必须首先在实验动物身上进行实验研究。因此，保证实验动物的质量和了解实验动物生殖和发育等特点，是十分重要。

（一）常用实验动物的繁殖周期特点

计划生育研究中常用的实验动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔狗、恒河猴等，各种动物的性周期、排卵时间及妊娠期都各不相同。如狗是季节性单发情，猫季节性多次发情，而鼠、豚鼠全年都有动情周期的循环，灵长类有月经周期，但只有一定季节才排卵（见下页表10-37）

（二）常用实验动物排卵和性周期特点

哺乳动物的排卵可分为两种类型，一般动物是按一定的周期进行排卵的，这类动物不交配也可正常排卵，此称为自发排卵或非刺激性排卵；而兔子、猫、雪貂（白鼬）、水貂等，只有经过交配的刺激才能进行排卵，此称为诱发排卵，也称刺激性排卵或反射性排卵。例如兔子的卵巢几乎连续不断地产生卵子，但成熟的卵泡只有经过雄兔交配后才能排卵。这是因为雌兔受到雄兔爬跨时，垂体受到兴奋而引起的刺激，这种刺激出现在交配后1小时，此时垂体释放排卵素（黄体生物素），在促排卵素的影响下大约在交配后10～12小时发生排卵。如果没有交配刺激，成熟的卵泡自行退化，经10～16小时逐渐被吸收，而新的卵泡又开始成熟。

雌性哺乳动物的性周期可分为三型

第一型包括狗、马、牛以及其他哺乳动物的性周期。该型性周期又可分为前半期和后半期。前半期由雌激素所控制，雌激素的效果逐渐变强，至发情期达到最高程度。这个时期，卵巢内卵泡成熟，随后便引起排卵，随着排卵，雌激素的作用逐渐减弱，以后即转入以孕激素所控制的后半期。如果没有妊娠，黄体退化，则又转为由雌激素所控制的新的性周期。总之，在这一性周期中，雌激素作用的期间和孕激素作用的期间是相继出现的，在两期之间排卵。第一型是基本型。

第二型包括小白鼠、大白鼠、田鼠类、土拔鼠和沙鼠的性周期。这类动物在发情期排卵，也形成黄体，但生成的黄体不能分泌孕激素并立即退化，即没有第一型的后半期，所以性周期是短的。如果妊娠了，黄体继续存在，称为妊娠黄体，能分泌黄体酮。

第三型包括兔子、猫等的性周期，这类动物如果不交配就不引起排卵，也不形成黄体，成熟的卵泡逐渐退化消失，随后又有新的卵泡成熟，并不断反复进行更新，这种情况下的性周期约为15～16天（成熟卵泡的寿命为13天，卵泡退化约1～2天）；如果进行交配，则引起排卵，产生黄体，分泌孕激素；若没有受精，则所形成的假妊娠黄体约经20天退化。

表10-37　实验动物繁殖周期

动物种类	第一次交配年龄	发情周期（天）	发情持续期	排卵时间	受精卵进入子宫时间	植入开始时间	妊娠期
狗	1（1/2）～2岁雄狗2岁	发情期间隔4～8个月，春秋以品种不同而不同	9（4～13）天	发情第3或4天	交配后5～6天	交配后15天	60天（58～63）
猫	6～8月龄	季节性强，春秋季节多次发情15～28	4（3～10）天	诱发排卵，交配后27小时	排卵后4天	交配后13天	63天（52～69）
兔	4～5月龄	多次发情	时间界限不明显	诱发排卵，交配后10.5小时	交配后4天	交配后7～8天	32天（29～36）
大白鼠	8～10月龄	4.5(4～5)	14小时	发情开始后10小时	交配后3～4天	交配后5～6天	22天（19～23）
小白鼠	6～8月龄	5（4～7）	6～24小时	发情开始后2～3小时	交配后3～4天	交配后4～5天	19-21天
豚鼠	雄性6月龄雌性5月龄	16.5(12～18)	8小时	发情开始后10小时	交配后3～4天	交配后5～7天	70天（69～75）
恒河猴	第3～5次性周期后才可进行交配	月经周期28（23～33）	时间界限不明显一般为4～6小时	月经周期9～20天接近发情结束时	交配后4天	交配后9天	164天（156～180）

实验动物性季节（繁殖季节）差异较大，兔、小白鼠、大白鼠、猪等一年四季都有性的活动（妊娠时除外），这类动物称为“常年多次发情（或常年发情动物）”，其繁殖力很强。狗的发情有一定的季节性，雌狗一年内发情两次，多在春秋两季，每次发情持续14～21天，每次发情的间隔期约7个月。猫的繁殖季节，北半球是3～8月分，南半球是9月到次年的2月份。欧洲田鼠的繁殖季节是4～8月份。羊的繁殖季节在秋季（7～10月份），羊也是“季节性多次发情”。

实验动物性周期一般分为四期：发情前期，发情期、发情后期和发情间期（休情期）。有的还将发情后期分为二期（后情一期和二期）。

小鼠动情周期一般分为五期（其中动情后分为二期），约120～144小时。大鼠动情周期为96～120小时。

哺乳类雌性动物在性成熟后出现动情周期变化，其中啮齿类动物在动情周期不同阶段，阴道粘膜发生比较典型的变化。因次，根据阴道涂片法的细胞学改变，可以推断卵巢功能的周期变化。方法是用圆头滴管吸少许生理盐不滴入阴道口，轻轻冲吸一点阴道液体作涂片，待涂片干燥后，用10%福尔马林或95%酒精固定，经苏木精一伊红染色后作镜检（表10-38）。

表10-38　动情周期阴道涂片的细胞变化特点

阶　段	经过时间（小时）		卵巢变化	细　胞　变　化　特　点
	小鼠	大鼠
动情前期（P）(Proestrus　Stage)	10	17～21	卵泡加速生长	全部是有核上皮细胞，偶有少量角化细胞
动情期（E）（Estrus　Stage）	42	9～15	卵胞成熟排卵	全部是无核角化细胞或间有少量上皮细胞
动情后期（M）（Metestrus　Stage）	12	10～14	黄体生成	白细胞、角化细胞、有核上皮细胞均有
动情间期（DI）(Diestrus　Stage)	48～72	60～70	黄体退化	大量白细胞及少量上皮细胞和粘膜

（三）常用实验动物精子和卵子的运输特点

1．精子的运输哺乳动物精子从阴道到输卵管是很快的。马、猪和大鼠在交配后很短时间，子宫腔内就看到了精子。这些动物由于在交配时宫颈口舒张，所以精子直接射到子宫腔内。兔精子进入子大约需要1～3小时。

精子获能是一个生理过程，即精子获得穿透新排出卵的透明带的能力。这个过程对一些动物的受精作用是必需的。兔精子获能需要6小时，大鼠2～3小时，羊约1.5小时，雪貂大约3.5小时。实验证明兔、大鼠、小鼠、地鼠、羊和雪貂精子的获能是必需的。

哺乳动物精子在进入雌性生殖道以后，对卵的受精能力局限于很短一段时间。各种动物在雌性生殖道内有生育能力的时间有很大变化（表10-39）。

表10-39　精子在雌性生殖道内的生育力和活动力的时间

实验动物	生育力最长时间（小时）	活动力最长时间（小时）
小　鼠	6	13
大　鼠	14	17
豚　鼠	21～22	41
兔	30～32	-
雪　貂	36～48;126	-
牛	28～50	96
羊	30～48	48
马	144	144
蝙　蝠	135天	159天

在整个动情期，小白鼠子宫为液体充满而扩张，子宫壁产生蠕动，可以推动精子随液体进入输卵管，在输卵管内，精子移动较慢，约在交配后15分钟到1小时之内，始能到达输卵管壶腹部。精子在输卵管内保持受精力不超过6小时，但活动力可长达13.5小时。精子要经过在子宫或输卵管中液体的处理后才能获得受精能力。

2．卵的运输当卵泡破裂时，有一部分卵泡液随之流出，卵被排到围卵巢腔内，所以不发生漏到腹腔内的现象。当动情期时，围卵腔变大并产生一种液体，能把卵带到输卵管伞部，加之漏斗部的绒毛活动和输卵管的收缩帮助卵运输到输卵管下段。

卵子的大小并不取决于动物的个体，而几乎完全取决于所积累的卵黄含量的多少。各种常用实验动物的卵子直径（μm）如下：

鼷鼠　75～87.8　狗　135～145　猫　120～130

小白鼠　70～75　豚鼠　75～85　水貂　107

大白鼠　70～75　兔　120～120　猴　125～143

卵由卵巢滤泡运输到子宫腔的时间约3～4天，常用实验动物输卵管内卵的运输情况和受精时间见表10-40和10-41。

表10-40　卵子经过输卵管的时间

动　物	出发点	卵在输卵管的时间（天）	进入子宫时间
人	排　卵	3	12个细胞
猴	排　卵	4	16个细胞
兔	交　配	3-4	桑椹早期总胚泡后期
仓　鼠	交　配	2.5	4-8个细胞
豚　鼠	交　配	4	4-8个细胞
大　鼠	交　配	3.5-5	桑椹早期至胚泡后期
小　鼠	交　配	3	桑椹早期至胚泡后期
牛	排　卵	3-4	8-16个细胞
猪	交　配	4-5	3-4个细胞
羊	交　配	3-4	-

10-41　哺乳动物卵的受精时间

动　物	受精时间（小时）
人	6-24
猴	23
兔	6-8
仓　鼠	5
豚　鼠	20
大　鼠	12
小　鼠	8
雪　貂	30
牛	18-20
绵　羊	24

（四）常用实验动物着床、哺乳、胚胎发育特点

常用实验动物着床、哺乳、胚胎发育特点可参考表10-42至10-44。

表10-42　各种动物着床时间

品　种	着　床　时　间
小　鼠	5天
大　鼠	5-6天
豚　鼠	6-7天
人	6-7天
兔	7-8天
雪　貂	7-8天
猕　猴	9-11天
猪	约11天
犬	13-14天
猫	13-14天
绵　羊	17-18天
牛	30-35天
马	8-9星期

表10-43　各种动物的哺乳期和乳腺数

动　物	哺　乳　期	乳　腺　数
狗	60天	5对
猫	7周（也有4～5周断奶的）	4～6对
兔　子	42天	8～12对
豚　鼠	21天	1对
大白鼠	20～25天	6对（胸腺各3对）
小白鼠	17～20天	5对（胸部3对腹部2对）
田　鼠	21（20～25）天	7～8对
沙　鼠	21天
老　鼠	20天
猪	60天	5～7对
绵　羊	4个月	1对
山　羊	3个月	1对

表10-44　实验小鼠和大鼠各胚胎发育时期的变化

时期	胎龄（日）		胚　胎　发　育
	小　鼠	大　鼠
1	1	1	单核细胞（输卵管内）
2		2	2细胞期（输卵管内）
3	2	3.25	4细胞期（输卵管内）
4	2.5	3.5	8-12细胞期（输卵管内）
5	3	3.	桑椹期（输卵管—子宫上部）
6	3.5	4	囊胚初期（子宫内）
7	4	5	囊胚期
8	4.5	6	植入开始
9	5	6.75	内外胚层分化
10	5.5	7.25	植入末期，卵黄腔形成，分化成内外胚层，
11	6.5	7.75	植入完毕，出现羊膜。
12	7	8.5	出现中胚层和原条。
13	7.5	9	出现神经板，头部突起，出现尿膜褶。
14	7.75	9.5	体节1-4（头部）完成外层胎盘。
15	8～8.5	10	腔，胚外体腔内和羊膜腔发育。体节5-12（颈椎部）
			形成神经沟，胚回转开始。
16	8.5～9	10.5	体节13-20（胸椎前部）胚回转结束。
17	9.5	11	体节21-25（胸椎后部），神经沟闭锁。
18	10	11.5	体节26-28（腰椎前部），前肢出现。
19	10.25	11.75	体节29-31（腰椎后部），后肢出现。
20			体节32-33（荐椎后部）。
21		12	体节34、35（荐椎后部）。
22	10.5		体节36（第一层尾椎）鼻窝形成
23			体节37、38（尾椎）。
24			体节39、40（尾椎）。
25	11	12.5	体节41、42，前肢变大。
26			体节43-45（尾椎）手指分化。
27	12	13	体节46-48（尾椎）脐疝明显。
28	12.5	13.5	体节49-51（尾椎），鼻上颌闭锁。
29		14	体节52-55（尾椎）。
30	13	14.5	体节56-60（尾椎），耳孔开，耳壳形成
31	13.5～14	15	体节61-63（尾椎），口盖板闭锁
32	14.5	15.5	体节64（尾椎）、体表出现毛囊。
33	15	16	体节65（最终尾椎）
34	16-16.5	17-18	脐疝消失，眼脸、耳壳闭锁。
35	17-19	19-22	胎盘发育显著。临产。

（五）8常用实验动物的生殖结构特点

1．乳腺分布特点

常用实验动物乳腺分布特点见图10-9。

图10-9　常用实验动物乳腺分布特点

2．子宫结构特点

家兔的子宫属于双子宫型，是由一对几乎独立的、游离的子宫弯曲而成，两个子宫各有一个子宫颈分别与同一个阴道相通，即两个子宫的子宫颈共同开口于同一个阴道。所以，兔的子宫无所谓子宫角或子宫体，只是一对筒状结构，每只长度平均约7厘米，宽约3-4mm，但妊娠后期的子宫，在腹腔内可以扩展到很大的范围。

啮齿类动物的子宫均属双子宫型。其中，大白鼠的子宫呈Y字形排列，左左两个子宫颈开口于共同阴道和家兔的子宫一样，属于双子宫，双子宫颈，单阴道类型。

豚鼠的子宫属于双角型子宫，两个子宫角长约3～5cm，直径约5mm，背腹扁平。子宫体长约2cm，直径6mm，亦是背腹压扁。比子宫角略宽一点。子宫颈有两个内口，但只有一个公共外口。

肉食动物的子宫属于双角型子宫。具有发育良好的二个子宫角，单子宫体，单子宫颈和单阴道，不过左右两个子宫腔愈合范围较大，未愈合部分则形成弓状弯曲的子宫角。狗的子宫角细而长，子宫体很短，角体比例在5～6：1。中等体形的狗，子宫角长约12～15厘米，子宫体长约2～3厘米。另外，狗的子宫角腔内径均匀，没有弯曲，近乎直线。子宫颈很短，含有厚的肌肉层。

猫的双角子宫也很明显，但子宫体约4厘米，无论是相对比例还是绝对长度均比狗的子宫体长。

灵长类的子宫属于单子宫型、梨状，无子宫角，输卵管直接开口于子宫腔。常用实验动物子宫类型见图10-10。

3．胎盘类型牛、马、猪为上皮绒膜型；绵羊、山羊为结缔绒膜型；狗、猫为内皮绒膜型；兔为血内皮型；大鼠、豚鼠、恒河猴为血绒膜型。

4．生殖腺结构　可参看表10-45和10-46。

图10-10　常用实验动物子宫类型

表10-45　雄性动物生殖结构的比较解剖特点

动物种类	睾丸	壶腹腺	储精囊	前列腺	尿道球部腺体	前列周围腺体	阴茎骨	尿道腺体	球腺体	包皮腺体	腹股沟腺体
蝙蝠	3×2	4×15	A	5×3	1×1	A	F	F	A	A	A
猫	14×8	A	A	5×2	4×3	A	F	A	A	A	A
狗	40×30	F	A	25×16	A	A	F	A	A	A	A
沙土鼠	14×9	6×5	20×12	9×7	6×4	A	F	F	A	A	A
豚鼠	25×15	A	115×7	15×8	8×5	A	F	A	A	PD	A
田鼠	14×11	3×3	11×6	8×6	4×3	A	F	F	A	3×1	A
貂类	11×8	F	A	10×5	A	A	F	A	A	A	A
小鼠	6×4	2×1	13×4	4×4	3×2	A	F	F	A	6×5	A
兔（美国）	35×15	15×4	19×7	19×6	6×3	6×2	A	A	A	A	15×7
袋鼠	15×11	A	A	40×9	19×15	A	A	A	A	A	A
兔	35×17	F	A	25×6	6×2	A	A	A	A	A	10×4
大鼠	20×12	4×4	20×10	13×10	5×3	A	F	F	A	16×4	A
地鼠	3×2	3×1	A	3×1.5	1×1	A	A	A	A	分散的	A
树松鼠	30×12	F	7×4	28×18	13×13	A	F	A	10×7	A	A
地松鼠	14×8	F	8×7	18×18	8×6	A	F	A	10×8	F	A
类人猿	10×7	A	14×7	6×5	A	A	F	A	A	分散的	A
雪貂	F	F	A	F	A	A	F	A	A	A

注①F表示属于一种功能性腺体不能估量

②A表示这种结构不发生

③PD表示这种腺体是不发达的

④测量的单位为毫米

表10-46实验动物的副性腺

动　物	精　囊	前　列　腺	尿道球腺	凝　固　腺	包　皮　腺
狗	-	√	-	-	-
猫	-	√	√	-	-
兔	√	√	√	-	-
豚鼠	√	√	√	-	-
鼠类（大、小鼠）	√	√	√	√	√
猪	√	√	√	-	-
羊	√	√	√	-	-

狗缺少精囊和尿道球道腺，猫也没有精囊，雄兔还有前列旁腺，鼠类多一种凝固腺，大鼠和小鼠有包皮腺。

二、动物的选择与应用

（一）口服避孕药物的筛选研究

目前国内外广泛应用的口服避孕药（孕激素与雌激素的复合片以及单纯孕激素药片）其避孕效果都非常好，但还存在一定副作用。为了提高口服避孕药的可接受率，有必要寻找更加理想的、有效、安全、经济、方便的药物。

筛选口服避孕药的实验动物多使用啮齿类实验动物，因为它们具有规律的动情周期，排卵有明显的指标，易于检测，价格便宜，而具有月经周期的灵长类动物反而不是都被选择的对象。因为这类动物来源困难，价格昂贵，排卵和月经周期难于检测。

当动物实验证实某药物有抗生育的效果后，还必须进行各种药理实验。

1．孕激素活性测定　根据Mcphail的方法，以未成熟雌性家兔子宫内膜的变化为观察指标；

2．妊娠维持实验　一般选大鼠为动物模型；

3．雌激素活性及抗雌激素活性测定　用未成年或去卵巢未成熟大鼠为动物模型，以子宫称重或阴道涂片为观察指标；

4．雄激素活性及抗雄激素活性测定　用大鼠或小鼠为动物模型，以前列腺腹侧及储精囊称重为观察指标；

5．对促性腺激素分泌的影响　用啮齿类或其它种类动物为实验模型，以是否抑制排卵或测定外周血的促性腺激素含量为观察指标；

6．蜕镇痛形成实验　用小鼠为动物模型；

7．糖皮质激素活性测定　用大量为动物模型。

以上7个为基本实验，根据需要还可以增添其它实验。

（二）避孕药物的药理研究

1．　女用避孕药物　研究最基本方法是抗生育实验，就是在与雄性动物合笼前和合笼交配期间，给雌性动物服药，观察药物对生育的影响。以检查雌性动物怀孕百分率和每只孕鼠之胚胎数为指标。如果能找到一种药具有防止受精卵着床的作用或中断早期妊娠的作用，那就不必天天服药，而只在需要时服用。这是避孕药研究工作者多年来的一项设想。常需要作抗着床和抗早孕实验。抗着床实验是将雌鼠与雄鼠合笼，每天上午检查雌鼠阴道口有无阴栓，于出现阴栓后第1～5天，每日给药一次，于阴栓出现后第12天处死动物，以胚胎数和怀孕百分率为指标。阴栓是某些啮齿类动物在交配后，随即形成的一种白色浆液性物质，堵塞在阴道至子宫颈的腔内，称为阴栓（Vaginal　plug）。是检查动物已否交配的一种标志，将出现阴栓的当天算为妊娠“零天”。阴栓是由雄鼠精囊腺和凝固腺的分泌物在阴道内凝固而成的产物。小白鼠一般在交配后4～5分钟内形成。大的阴栓可凸出于阴道口，小的阴道或子宫颈内，需要翻开阴道口才能查见。阴栓一般在交配后一小时起渐渐软化，经16～24小时后脱落。但也有只存在4～5小时，而最多的可存在48小时以上。小鼠阴栓比较牢固，大鼠的阴栓不牢固，容易脱落，所以检查大鼠阴栓时，除检查阴道外，还应在笼底寻找阴栓。亦可用生理盐水冲洗阴道，在显微镜下检查冲洗液中有无精子，有精子表示已交配。抗早孕实验是在着床（出现阴栓后第5天着床）以后给药，一般于阴栓出现后第6～9天连续给药4天，第12天处理，以检查胚胎数和死胎为指标。抗生育、抗着床和抗早孕实验中最常用的动物为壮年的28～35g的小鼠，也可用体重200～250体重的大鼠。在探讨一个避孕药的作用原理时，有时需要检查一个药物有没有抑制排卵作用。需要进行抗排卵实验，常选用体重2～3.5kg的雌兔进行实验。

2．男用避孕药物研究　长期以来，对男用避孕药的研究不很重现，进展缓慢。药物能抑制精子的生成过程，干扰男性生殖活动的激素调节；干扰副性腺和改变精液的理化特性等，均可达到不孕的目的。现在认为，精子形态的成熟是在睾丸，而生理的成熟是在副睾。药物作用于副性腺，干扰精子成熟或改变精液理化性质所引起的男性不孕似较理想。常选用成年雄性大白鼠作实验，如观察药物对大白鼠生育力的影响；对大白鼠精子数的影响；对大白鼠精子活动力的影响以及对雄性激素的作用等。

实验中常需要采集实验动物的精液，采集的方法有电刺激法、假阴道法、按摩法以及直接杀取法。电刺激法适用于多种实验动物，尤其是野生实验动物的采精，其原理是通过刺激输卵管壶腹附近的神经末稍，引起低级射精中枢兴奋而促使动物射精。所用电刺激采精器的主要技术参数为：电源电压-交流220V；输出可调电压0～20V；可高频率20～60Hz：输出电流0～1000mA：输出波形-正弦波或方波。假阴道法是用硬质外壳衬以胶质内胎制成的采精器械，内部注以温水和充气，适当加以润滑，使其与雌性动物生殖道的内环境相似，以诱起雄性动物射精常，常适用于兔的采精。猫在有发情母猫引诱情况下，当公猫爬跨时，也可使用此法采精，但象水貂那样在交配时雌雄动物长时间紧密拥抱的动物，无法使用假阴道。按摩法主要用于狗的采精，这是因为狗在交配时，雄狗阴茎的球状海绵体充血胀大并和雌狗的阴道锁结，采取假阴道法采精有一定困难，故多采用按摩法。狗的射精分为3段，前段为尿道腺的分泌物，约为0.25～2.0ml的透明液体：中段排出的是浓精，约0.5～3.0ml；第3段则为大量透明的前列腺分泌物，量可达3～20ml，但几乎不含精子。按摩法对于调教好的雄狗方便易行，并可存细胞观察射精情况，收集所需部分，无需特殊设备。但不能用于野生犬科或陌生猛犬。直接杀取法适于前面几种方法不适用时采用，如小白鼠、水貂等，系将动物处死，取其输卵管和附睾丸，用生理盐水或其它专门稀释液冲洗，制成精子悬浮液备用。常用实验动物采精方法和精液特点见表10-47。

表10-47　各种动物精液采取方法和精液特点

动物	采取法	交配时间	射精时间	颜色	精液量（毫升）	精液密度万/立方毫米	活力	畸形率%	pH
牛	假阴道法电刺激法	瞬间	瞬间	乳白	5～6	90～100	卅70<	10	6.6～6.8
马	假阴道法阴道内采取	暂时	数秒至10数秒	淡	50～150	20～30	同上	5	7.2～7.6
猪	假阴道法	10分	5～10分	灰白	200～300	20	同上	5～10	6.4～7.4
绵羊	假阴道法电刺激法	瞬间	瞬间	乳白	0.5～0.2	300	同上	同上	6.4～7.2
山羊	同上	同上	同上	乳白带黄	同上	同上	同上	同上	同上
狗	按摩法　假阴道法	10分	1分	乳白	0.5～3.0	10～15	同上	10～15	6.6～6.8
家兔	假阴道法阴道内采取	10秒	瞬间	乳白	0.5～1.0	50～60	同上	同上	6.6～6.8
大鼠	乙醚麻醉	同上	同上	乳白	同上	0.1		同上	-
鸡	电刺激法	2秒	1秒	同上	0.1～0.5	200～500	卄卅　70<	<20	6.5～7.4

（三）中枢神经系统对促性腺激素分泌的调节作用研究

不同动物的中枢神经系统对垂体促性腺激素分泌的调节是有很大差异的。如灵长类和大鼠的垂体以同样的方式对促黄体素释放激素起反应，并以同样的形式被大剂量雌激素或雄激素所抑制。这两种动物的中枢神经系统，在自发性排卵中都是必不可少的,这是它们的共同点。但调节大鼠促性腺激素释放的中枢是视前结节系统，若视前区受损，则在排卵前雌激素不能导致促黄体激素的释放。而这一区域受损不影响恒河猴促黄体激素的释放，因为恒河猴促性腺素释放的调节中枢是结节漏头斗状系统，这是它们的不同点。

在中枢神经系统对促性腺激素调节的研究中，大鼠是常用的动物模型，因这方面已积累了大量的有关研究资料：价格便宜，易于饲养，有规律的性周期便于检测，且周期短，易于安排实验，排卵前有自发的LH峰，所得的结果一般易于在猴子身上得到重复。

阴道涂片可以准确地判断大鼠和小鼠动情周期的各个阶段，从而可推测排卵前LH峰及排卵，但此方法很少用于田鼠，因为田鼠在动情周期阴道有渗出物，所以不一定要做阴道涂片。推测灵长类LH峰，须测定外周血的孕激素水平，如单独根据月经出血期来推测有可能导致判断的错误。

大鼠、小鼠和田鼠的黄体期不能自发地变成功能性黄体，在正常情况下，需交配诱发黄体激素的分泌，而恒河猴和人则自发性功能黄体。家兔和猫是诱发性（交配）排卵，一旦排卵发生，则黄体能自发地变为功能性的。

（四）神经内分泌学研究

通过对人性行为的内分泌研究，发现人类性活动大多可以用动物实验来阐明，而最好的动物模型不一定是灵长类。Nadle分析了大猩猩、黑猩猩和猩猩的性活动行为，结果发现在新皮层发育及智能上，他们大体上是相等的，但在性活动方面却有很大的不同，大猩猩交配大多集中在月经周期中期，且雌性动物起主导作用，猩猩可以在周期的任何时期进行交配，没有明显的排卵标志，雄性动物的性要求很强烈，在交配中占主导地位，黑猩猩属这两者之间。所以虽然灵长类最接近人类，但用它作神经内分泌学研究所得的结果也能完全适用于人，而较小的动物如大鼠，其性活动与人也有共同点，如在大鼠的动物实验及人类的临床观察中，均存在维持性功能的雄性激素水平比维持生育功能的水平低，人类性功能随年龄的增长而减退，某些器官出现肥大等变化在大鼠也都有发生，所以大鼠用于性活动研究，也是一个较好的模型。

第八节　微循环研究中实验动物的选择和应用

一、微循环研究中动物和实验方法的选择

（一）动物选择

远在300年前就有人观察了冷血动物的微循环，如青蛙的舌、蹼、肺和肠系膜；金鱼的尾巴；蝌蚪的尾巴；蜜蜂的眼睛……等等。在1831年Hall和1850年Paget等详细地描述了蝙蝠翅膀的微循环，但是这些动物都离人的抗体结构和生理功能太远。蝙蝠虽然是所谓的哺乳动物，但其生活习性却与一般哺乳动物大不相同，其机体反应性也因其感觉器官之独特而区别于人，美国有的实验室（Nicoll,1946;Mohos,1961;Wiedeman,1972）用蝙蝠观察微循环时，事先需将蝙蝠养于温度为5～10℃并且湿度极大的冰箱中。又因蝙蝠是夜醒动物，其神经系统白天处于抑制状态，所以不适于进行微循环各项生理参数的测定。更不宜于选它为靶子进行微循环对各种药物应答反应的研究。

国际、国内通常用以进行微循环研究的动物有：小白鼠、大白鼠、金黄地鼠、家兔、猫、狗，最近也有用羊、小牛或猴子的。

（二）研究微循环方法的选择

研究微循环的方法很多，有间接法（如⁸⁶Rb测心肌营养性血流量）和显微直接观察法之分。后者一般又分两大类：一类是体表微循环实验方法，另一类是内脏微循环实验方法。体表微循环动物实验方法有金黄地鼠颊囊循环，家兔眼球结膜和眼睑微循环，家兔舌尖微循环，蝌蚪尾部微循环，还有兔耳、兔耳透明窗和大白鼠气管微循环等。

内脏微循环的实验研究方法也很多，有用动物的肠系膜、心肌和肝脏等来观察研究其微循环，其中观察肠系膜的方法种类较多，可用大白鼠、家兔、豚鼠、小白鼠等的肠系膜。也有利用脏器“开窗”手术作慢性实验，例如动物行头颅和腹腔开窗术，观察脑和腹腔有关内脏的微循环。还有取用观察部位的活组织电子显微镜观察并作超微结构摄影。

当前物理化学的研究方法－－血液流变学也不断被采用，例如红细胞电泳、血粘度的测定，测定微血管的压力，血小板和红细胞凝集功能的测定，血小板粘附性的测定等方面的研究以及观察毛细血管通透性的变化等。

近代先进技术的不断发展，无疑地也推动着微循环实验方法的不断更新和发展，运用放射性同位素⁸⁶Rb测定小鼠心肌营养性血流量，因心肌摄取⁸⁶Rb的能力和心肌毛细血流量成正比。

近年来国外使用电视一电子系统、激光显微系统、快速摄影、微循环电影和磁带录像等新技术研究微循环，这必将使微循环方法的科学性和客观性大大地提高。

二、进行微循环动物实验的几个原则

（一）动物的麻醉

远在1944年曾有人在微循环的研究中发现：给小动物进行戊巴

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有些实验动物不需麻醉，可在动物清醒状态下进行，如兔眼球结膜微循环的检查方法等。

（二）恒温灌流

原则上，动物器官或组织的灌流液应是与该器官或组织周围体液环境的成份和pH完全一样，例如对肠系膜来说应有腹腔内液的环境，但是很难做到的。

Zweifach认为：无论应用什么灌流液，首先应使它成为胶体状态，即在灌流液中加入明胶，使之成为1%的明胶溶液。

灌流液中应该通过适量的氧和二氧化碳。灌流液的pH应以缓冲液调至中性（pH为7.35）灌流液的温度应以控制器控制在动物正常体温范围。灌流液在整个实验过程中应不停地慢速更换。常用的灌流液有林格氏液、台氏液、凯氏液、生理盐水等。灌流装置和所观察的动物应放在装有可调节的恒温实验观察箱中进行，此点在冬季显得尤为重要。将实验观察箱中的温度调节到与实验动物体表温度相近的温度，最好在25～30℃。

（三）照明装置

照明装置的温度一般不能超过动物体温。最好保持在25～30℃，否则会引起血管扩张及微血流异常。照射灯光最好不改变血液自然的色调，否则不易辨别血氧饱和程度。最理想的照明装置是纤维光束冷光源，尤其在进行肝、脾、肾等脏器的微循环观察时，没有可以伸进腹腔去的冷光源照明棒是很难进行实验的。

实验时用的照明光源，应该具备三个条件，即强、聚、“冷”。目前常用的有两种照明装置，一种是高压水银灯（220V，80W），此光源的优点是光线强，产热较少，血管与底色间反差强，缺点是血色不真实，光源触发启动慢。另一种是钨卤素灯（5～12V，40～100W），后者具有体积小巧，光线白亮，启动快的优点。钨卤素灯可用显微镜灯加以改装，因其有透镜，能调节焦距，又能达到“聚光”的目的，再在此灯前加上蓝绿色的隔热滤光片，即可控制光源温度，达到相对“冷光”的要求。此种照明光源能在普通室内保证显微镜下视野清晰，而且对观察指标影响较小。

（四）记录系统

动物微循环的瞬间变化常采用显微摄影装置来记录。选择好显微照相装置及相应的洗相设备。为了保证摄影的成功，凡是活体摄影，均需要使用拆射光源，要使用快片（24定以上的微粒胶卷）摄影，这是一个关键问题，还要增强反差（用绿色滤光片增强血管与底色间的的反差）。

照相机是一般的记录工具，它只能留下瞬间的图象，有条件最好能拍摄电影或进行彩色磁带录像。

对于管径扫描的曲线、血流流态曲线或微压力曲线要用示波器或多导记录器进行记录，如能用微处理机记录并贮存上述信号则更理想。

三、观察动物微循环障碍时的主要指标

（一）管径

用目镜测微器测量微细动脉与静脉的管径大小。如有摄影设备，在每次观测中摄片，然后用量规在照片上量取管径；或将微血管放大若干倍投影于示教屏上，再用量规在示教屏上量取管径。示教屏上的长度则事先通过物镜测微顺标定好。

微血管的管径还可采用较先进的仪器来测量，如可用微电脑控制的多功能显微图像测量分析仪来测量。该分析仪能对实验时微观结构进行一维（线径、周长）及二维（面积、环）的参数测量，测量精度分别为±1%、±1.5%，从而可对微观察结构变化前后作定量分析比较。并且可对运动目标自动测速，精度±2%。对被测量对象的线径动态变化进行测量和记录，对微粒进行计数。现我国上海已有生产。

（二）流速

目前测定血流速度的方法有两种。一种是秒表法－－用目镜测微器和秒表测定，计算血细胞流径口径2～3个红细胞的微血管1mm距离所需的时间，重复测定三次，取其平均值。若作动态比较时应选择固定血管进行观察，此法仅在流速较慢时应用。另一种是示波器光点扫描同步法。该方法的基本原理是将示波器上扫描的光点与镜下见到的流动的红细胞，使之在皮层视觉感受区内重叠，以致造成光点与红细胞在同一视野中流动画面，调节示波器上的粗调和微调，使之示波器光点扫描速度与红细胞流速同步，这时示波器上的读数即可代表红细胞的流速。有条件时可采用上述图象分析仪测量。

（三）流态

描述血细胞流动时的形态。正常时在口径为1个红细胞的微血管中，血细胞流态呈直线状。当静脉注射高分子右旋糖酐引起微循环障碍后，血液流态和血液流速均有异常改变。血流状态由正常的直线状变为断线状或虚线状。在口径为2～3个红细胞的微血管中，正常时，流态可呈带状，给予高分子右旋糖酐后，变为粒状、絮状，甚至出现流动的微小血栓。此时血液速显著减慢，甚至有的血管区内出现来回摆动和暂停现象。

（四）毛细胞管网交点计数

计数的方法是：取面积约为1mm²左右的四周由血管围或边界的固定血管区域，计算此血管区域中的毛细血管与边界血管的交点数，未与边界相交的毛细血管不计算在内。

（五）血色

血色分鲜红、暗红和淡红等。正常血色为鲜红色。观察造成微循环障碍和给药后血色的变化情况。

四、可进行微循环观察的动物器官及方法

（一）头部器官

动物的眼球结膜、虹膜、眼底、鼻粘膜、口唇、牙龈、舌、鼓膜、耳壳等都可以普通显微镜在放大40倍到100倍的条件下进行微循环观察。这些部位的动物观察方法与人的相似。以家兔眼球结膜观察方法为例：要选用白色家兔，因其球结膜色白，微血管精晰可见。不可采用灰色或黑色的家兔，因其球结膜色深，不易辨别其微血管。将2～2.5kg体重的白毛家兔的在清醒状态下侧卧位置于一特制的长方形固定盒内，使两耳及其头部露出，头颈部和嘴用兔头夹和铁环加以固定，剪去左侧眼睑睫毛，以眼科开睑器将上下眼睑撑开，暴露出球结膜血管，然后用高压水银聚光灯，以45度斜照于球结膜上，双目解剖显微镜放大40倍，可直接观察到球结膜的微循环。

（二）气管微循环观察法

选用大白鼠或家兔麻醉后，剪去下颌及颈部的毛，消毒皮肤，固定四肢（仰卧）。沿颈正中线自下颌部甚胸骨上缘作垂直切口，剥离软组织与肌肉，小心不要损伤血管，用两把纹式止血钳夹住两胸锁乳突肌中部轻轻拉开。于甲状软骨环上轻轻剪断一对胸骨甲状肌及其附着的肌膜，将该肌肉放于远端，便可暴露自甲状软骨至第十软骨环间区的气管，轻轻于解剖镜下（放大16倍）剔去气管表面的结缔组织，便可以将光射于放大60倍左右的气管软骨上以及软骨环间区的粘膜上观察微循环的动态变化。观察应于恒温装置中进行，并在气管表面滴以恒温灌流液。

正常大鼠或家兔气管软骨环间区的微血管较为丰富。细静脉、细动脉血流方向相反，毛细血管网穿插于细动脉和细静脉间，而在软骨环表面上有极细的毛细管网。微血管内血流均匀，流速较快，血管充盈度良好。连续观察25～30分钟不见有明显改变。气管炎模型的大鼠气管微循环出现明显变化，变化程度与气管粘膜病变程度密相关。活血化瘀药物注入后，可明显改善大鼠气管炎微循环障碍。

（三）肺微循环观察方法

一般用家兔、猫、狗或其它大动物进行。动物麻醉后呈右侧卧位固定于动物台上，净皮、去左胸部的毛，消毒皮肤。于第三、四肋间作弧形切口，剥离皮肤，沿胸骨边缘轻轻剪断胸大肌、胸小肌的附着处，将二肌肉剥向一边。在三、四肋间沿肋骨边缘用钝头眼科剪和眼科镊轻轻剔去肋间肌。注意要特别小心，谨防损伤胸膜。只要在胸膜上造成针尖大小的孔，肺便可发生萎陷。因此，肋间肌要一束一束仔细地剔去。最后可暴露无遗1cm见方的窗，透过透明的胸膜于显微镜下观察肺循环动态。此即“胸膜开窗”法。

开窗部位最好在第三、四肋间或第五、六肋间靠中线的地方。此外较薄的肺叶以心包作衬底，易于观察。由于观察的是呼吸着的肺，所以观察者要善于抓住动物的呼吸规律，选其呼吸空间进行观察，也可进行照明。

“胸膜开窗”是观察活体肺微循环的唯一可行的办法，因为肺脏一暴露于空气下便萎缩。如能将染料注入法、同位素注入或荧光示踪及肺血流量测定法与胸膜开窗活体观察法配合进行，便可得到更理想的结果。“胸膜开窗”观察肺微循环是可以连续进行的；第一次观察完毕后，可用一圆形有机玻璃薄片敷于窗上，以缝线固定于周围肌肉，将胸小肌、胸大肌恢复原位，缝合皮肤切口，加强护理。可于第2天、第3天、第4天连续重复上述步骤，进行反复观察。一般在第4、5天，胸膜上便生出一层结缔组织，变为不透明。此时如有必要可选其它肋间进行再次开窗，手术应在消毒条件下进行。

（四）背斜方肌微循环观察法

大鼠背斜方肌很薄，表浅，易于照明，面积宽而长，血管神经可保持完整。制备方便而简单，10～15分钟可完成全部制备。此外皮肤切口可丝毫不损伤周围组织，而且不易造成出血。对动物整个机体影响不太大，可进行长时间观察，而且这个部位易于进行显微镜下观察。因此，背斜方肌对于研究血管活性物质和机体对药物的应答反应是非常方便和理想的。

背斜方肌又称脊肩胛肌，是成对的肌肉，它纵伸于背部到腰部，它的肌纤维自第4胸椎至第3腰，并向两边伸展至肩胛线，它的神经支配来自脊副神经和第2、3颈部神经。它的供血来自腋动脉的肩胛下支和颈表浅动脉有肌肉分支。它的静脉注入前颈静脉。

实验采用大白鼠或金黄地鼠，体重70～120g，高于120g体重的鼠其背斜方肌过大过厚，不利于照明。用30mg/100g剂量戊巴比妥钠麻醉。将动物背部去毛、消毒。自颈部至腰部沿脊柱中线作皮肤切口。剥离结缔组织，用小虹膜剪将肌肉筋膜轻轻剥离，在肌肉侧面作一小小切口并用小弯剪轻轻剥开肌肉游离面（沿肩胛线），将小剪伸向肌肉底部将其完全与底层肌肉剥离。如遇有一两支小血管可以用4号将线结扎。这样便可得到一个宽为1.5cm左右的游离肌肉瓣。观察时使动物侧卧，将肌肉游离边用细大头针固定于特制灌流盒上（与金黄地鼠灌流盒类似）。用含有1％明胶的林格氏液灌流。用NaHCO3将pH调为7.35，灌流液保持35～37℃。

利用脊斜方肌制备可进行低倍、高倍、水镜、油镜观察。可以进行极漂亮的电影拍摄，可以清晰地分辩粘附于管壁的白血球。可以进行各种药物作用的研究，尤其适于微电极插入或微传感器插管进行在体微血管压力和微血流测定。

（五）颊囊微循环观察法

实验选用叙利亚种金黄地鼠，雄性，体重90～120g，在动物口腔两侧后角各有一颊囊供贮存食物之用。颊囊组织与皮肤组织相似。是由纤维结缔组织、鳞状上皮、骨骼肌、疏松结缔组织四层构成。颊囊的伸缩性很大，其容量可由1～2ml扩张到5～6ml。颊囊血供丰富，有致密的微血管网，是各种口径的微血管高度集中之地。颊囊组织薄而嫩，颜色淡，透光性好，微血管清晰，制备简单，既可作急性实验，也可作慢性连续观察实验，而且由于它是双侧对称器官，有些实验过程可在同一动物身上进行自身照射。

1．颊囊的简单制备　实验时，动物腹腔注以2.5%戊巴比妥钠30mg/kg体重进行麻醉。然后将口腔打开，沿一侧颊边轻轻伸进中号钝头镊子，伸到肩部时夹住颊囊盲端，从口中取出内面翻于外的盲囊，以滴管用37℃左右的生理盐水冲净其上的食物残渣，将颊囊展平，用弯形大头针固定于以透明有机玻璃制作的颊囊灌流盒上。启动恒温灌流系统并将灌流盒置于显微镜下，即可以透射光观察颊囊上微血管各项指标（放大100倍以下）。如观察需放在100倍以上进行，则需制备单层颊囊。此时颊囊上选择一个毛细血管网最少的区域，剪一个小切口。如需大面积观察则可沿颊囊动脉平行部分作纵长切品，在切口边缘部尚可作小小横切（垂直向两边）。其后用小虹膜剪在解剖镜下将疏松结缔组织移去。经过这样制备的颊囊，在显微镜下成象更加清晰。

2．颊囊的恒温灌流　颊囊灌流盒底板形态如图10-11所示，是一个24×18cm²的透明有机玻璃板，板上固定以直径为6cm、高为0.8cm的圆槽，槽中套以直径为4cm、高为0.4cm的开口双层环槽。环槽中灌以弹性透明硅橡胶，由圆槽一边底部输入恒温灌流液，另一端输出灌流液。灌流液的pH应调为中性（pH=7.35）并通过氧气。灌流液的温度以控温仪或以恒温水浴控制在37℃。整个实验过程中，恒温灌流液以慢速徐徐通过颊囊表面及底面。

图10-11　金黄　地鼠颊市灌流装置

3．颊囊小室制备法

颊囊小室由底板和顶板组成，两板面积相同（直径为2～2.5cm）。顶板边缘有凹槽，中央有圆窗，圆窗粘以极薄的透明有机玻璃或云母片。底板由较薄的透明有机玻璃作成。两板在相应部位各有两个小孔。底板两孔处固定两个有机玻璃的小楔子，可穿进顶板上的两孔。

动物麻醉后，刮去一侧颊部、颈部及肩部的毛。先将颊囊从口内取出，以生理盐水冲洗净并放回。之后将小室底板用镊子轻轻塞入左侧颊囊，尽可能送到颊囊盲端。使动物右侧卧、固定。消毒皮肤，透过皮肤可触到入在颊囊中的底板的两楔，用消毒手术器械在两楔间皮肤作一小切口，并小心扩展切口到底板直径长。剥离结缔组织，使覆盖有颊囊膜的底板完全暴露于解剖镜下，用虹膜剪将膜上疏松结缔组织清除。注射不能损伤血管。为防止组织过干或发生血瘀，上述步骤要尽速进行。

上述步骤完毕后，于底板颊囊上滴以生理盐水，将1mm2的肿瘤组织块轻轻入于颊囊膜中央，迅速将顶板的两孔穿进底板两楔、盖紧（防止气泡进入），然后于每一楔孔滴以有机粘合剂，此时，于两板间形成一个小室，在此小室中肿瘤组织可生长。将皮肤切口边缘先以普通缝线穿一圈，再紧紧扎入顶板侧槽。于小室周围敷以胺黄粉。小室制备即完成。为防止感染，给动物每日肌内注射2500单位的多粘菌素B，3～4天。

利用颊囊小室法可进行多种恶性肿瘤移植的研究，如乳腺癌、黑色素瘤、血管周期细胞瘤、神经鞘瘤等，并可于瘤组织植入后任何时间透过小室以显微镜观察瘤组织周围血管再生及发育情况和特点。

（六）缝匠肌微循环观察法

实验选用猫。猫的缝匠肌是一种可以用于进行离体实验或在体透明实验的最好的肌肉。可以用以进行正常微血流、微血压、充血、出血以及胃骼肌微血流调节的研究。

缝匠肌是大腿内侧表浅肌肉，它起于髂前上棘，终于胫骨近端和髌骨。其内缘之下正是股动脉和股静脉，有9cm长，4cm宽，由它可取得平均5g重的离体肌肉。

缝匠肌的供血由侧旋股动脉及股动脉分支而来，其远端尚有下行膝动脉供血。

实验时，动物以75mg/kg体重剂量的α-氯醛醣静脉注射麻醉。动物侧卧位固定，将其一腿（下部的）伸展。净皮，去毛并消毒，沿大隐静脉走向自腹股沟下1cm处至膝内侧作皮肤切口，轻轻剥离皮肤。其后，于大腿内缘与该切口相平行作另一切口。尽可能将皮肤剥离以暴露更大面积的肌内。露暴软组织以恒温灌流液浸透的纱布湿敷。在将缝匠肌中间部位的筋膜、结缔组织剥离完全后，便可以用冷光束照明装置伸于缝匠肌正中底部，并于显微镜下观察该肌肉上的微血流和进行各种测定。

如要取得离体缝匠肌，需在上述步骤之后先将缝匠肌周围小血管一一结扎，只留下由大隐静脉和股动脉、股静脉而来的主要分支。此后，进行股动脉分支与股静脉分支插管（一支输入，一支输出）待插管圆满完成后将其它所有血管结扎（包括大隐静脉来的所有血管）。然后将肌肉两端以特制的小夹子夹住。从夹子外缘剪下，离体的肌肉挂在一个铝制支架上置于恒温，恒温装置可于显微镜下进行各种灌流实验。一块6g重的肌肉，其血液灌流量通常0.2～0.3ml/分。好的肌肉制备可连续维持6小时以上的实验。

（七）肠系膜、大网膜、肠壁微循环观察法

远在200年前就有人将肠系统、大网膜的微循环进行了显微镜观察。因为它最易取出，并且血管清晰。小鼠、大鼠、豚鼠、田鼠、家兔、猫、狗等动物的肠系膜和大网膜及肠壁皆可用于微循环观察，并且无明显差别，所用动物不宜过老，否则脂肪过多影响观察。Zweifach认为：回盲部肠系膜是最好的微循环观察区。因为它具有区域小而局限、没有肠蠕动、取出时不易损伤、脂肪组织少等优点。

实验时，动物麻醉同前。消毒腹部一侧皮肤，剪一个1～2寸的切口。动物侧卧于灌流盒边。取出欲观察的肠系膜或大网膜部位，轻轻伸展于透明有机玻璃制成的灌流盒上进行恒温灌流；灌流时流与滴相结合，灌流液用磷酸缓冲液调至pH7.2～7.35。灌流液中亦可加入白蛋白，使其成为1%白蛋白液。灌流液原瓶中通以O₂和5%CO₂。

在进行肠系膜微循环观察时，要特别注意维持动物体温恒定。因为过冷或过热都要引起不正常的肠蠕动，影响实验效果。为此，必须监测动物肛温或口温。连续记录体温曲线。动物最好躺在电热垫上并盖以小被维持恒定的正常体温。一般说来，一切条件保持得好，可连续进行两小时以上的正常实验，也可能5～6小时都保持平衡，应该停止实验的早期信号是：肠系膜上收集静脉中出现白细胞附壁粘着现象；其后是红血球渗出。因之，如不维持严格的恒温灌流和保持恒定的体温，所进行肠系膜的微循环动态记录肯定是不客观的。

家兔肠系膜微循环观察时，以乌拉坦或戊巴妥纳静脉注射麻醉后，背住缚于兔板上（有加温装置），剪去腹部之毛，沿腹中线作一长6～8cm的切口进入腹腔。将上腹腔脏器推向右侧，于腹腔左上方找到回盲交界处（回肠为浅红色，结肠为灰色）在该部位上的上段轻轻拉回肠袢约10cm，将该段肠管及系膜通过有机玻璃流盒的后侧壁凹槽和裤形装（见图10-12），然后浸入充满38℃灌流液的小盒中，并轻轻把肠系膜平铺在灌流盒的中央圆合上，用大头针将肠系膜固定于中央圆台内侧边的软木片上。将腹壁、浆膜层和肌层缝合，并把切口右缘皮肤缝合固定于灌流盒侧壁的锁眼处。

图10-12　检查家兔肠系膜微循环灌流盒

灌流盒右侧壁有一进水管与盛满任一台氏营养液的恒温压灌流瓶相连接，使营养液不断地流经小盒而自左侧壁的出水管口流出。以80W高压水银灯的光束投照平铺在中央圆台上的腹系膜上，双目显微镜放大40～80倍，可进行肠系膜血管口径、血流速度和血流状态观察。为了防止造成肠系膜的局部血流障碍和游斑性出血，要避免过分牵拉或摩擦肠系膜，要不断向肠系膜上滴加温热的生理盐水，避免干燥刺激。

（八）提睾丸微循环观察法

实验采用雄性大白鼠，体重80～110g，小于80g的大鼠提睾肌太小不利于制备，大于110g的大鼠太老，结缔组织增生，不利于观察。以25mg/kg体重剂量的戊巴比妥纳麻醉大鼠，或以130mg/100体重剂重的乌拉坦肌注（经常注入股田头肌）。将手术区域剃毛、洗净、消毒，最好进行气管切开，插管以保证呼吸顺利。进行股动脉插管测动脉压或准备静注药物。手术器械进行消毒。手术时，先用针在手术侧阴囊远端穿以缝线，将缝线固定在动物固定板的小钉上。然后在阴囊上作纵切口，切开皮肤、筋膜，轻轻剥离。将切口慢慢延长到离腹沟5～8mm处。用胶体林格氏液（pH7.35）开始轻轻灌流，于剥离的软组织上敷一层灌脱脂棉絮，棉絮浸以灌流液。将皮肤切口之每边穿两根丝线固定于动物板上。如图10-12所示，继续游离提睾肌，使之脱脑周围组织。将提睾肌轻轻作纵向切开并将其轻轻与睾丸剥离。用两个外科结扎连接睾丸和提睾肌的小血管，从两结中间剪断。如图10-13所示沿副睾纵柚将附睾系膜剪开。将睾丸和附睾经腹股沟环轻轻送入腹腔。提睾肌周围等距穿进5～6根丝线。动物仰卧，将提睾肌展铺于特制的马蹄形透明有机玻璃柱上，柱周围有等距的5～6个小钵，可将丝线结于钉上固定提睾肌。透明柱可调高低，其周围为恒温灌流盒（与金黄地鼠颊囊灌流装置相似）。

图10-13　分离提睾肌方法

提睾肌极薄，其上有各种口径的微血管，成像清晰，适于进行各种微循环参数测定，尤其独特的是提睾肌上最微细的毛细血管网也特别清楚，适于进行管腔、管壁动态变化和微血管与组织间物质交换的研究。也可用染料或荧光示踪剂进行淋巴微循环的研究。

五、几种简便常用的微循环障碍动物模型复制方法

（一）高分子右旋糖酐（HMWD）法

选择2～3公斤的健康家兔，雌雄不限。复制模型当天禁食、禁水。实验前观察眼球结膜微循环，采用微血管光滑、血流正常的动物，于清醒状态下复制模型。HMWD是一种多聚化合物，它能在红细胞间形成较多的稳定的间桥，表面桥力大于原来的电荷排斥力，从而造成红细胞聚集；加之其本身又是一种高粘度物质，还可增加血粘度。将平均分子量为20～40万的HMWD配成10%生理盐水溶液，以7～15ml/kg体重的剂量给家兔作耳缘静脉快速推注，如在用药同时作动物球结膜微循环活体观察，则可见到球结膜微循环中出现逐渐加强的血流缓慢，血细胞聚集，最后出现流动中的血细胞团块。用药前家兔眼球结微膜血管中的微动脉和毛细血管呈树枝状分布，微静脉常与微动脉平行，血管由粗到细，光滑均交，微血流呈带状或线状，偶可见到流动很快的粒线状血流，但不会有血细胞聚集的颗粒状血流出现。微动脉因血流较快呈线带状，常常不易看清其中的血细胞流动；毛细血管，特别是近瞳孔处的毛细血管网的血流常呈粒线状流动。正常时微血管周围无出血及渗出，因此微血管背景较白（巩膜），视野清晰。用药后，眼球结膜微循环中可见下列典型的急性微循环障碍表现：①毛细胞血管和微静脉中红细胞流速明显减慢，因此血流呈断线状、虚线状或粒状，局部区域甚至完全停滞；②微血管中出现明显的血细胞聚集，严重时见流动中的血细胞团块；③有时尚可见到微血管发生轻度痉挛，微血管周围有渗出和出血以及微静脉中有血细胞贴壁翻滚的现象。用药后24小时内，上述急性微循环障碍表现最严重，少数动物可因急性栓塞而突然死亡，也有少数动物出现偏瘫症状。存活者，如经仔细护理，则72小时后HMWD破坏、排泄，微循环障碍逐渐好转。经测定，在此种急性微循环障碍模型中，动物血粘度明显升高，红细胞电泳变慢，血沉加速。

这种急性微循环障碍动物模型的复制方法简便，出现快，成功率高（95%以上），适于探索与急性微循环障碍有关的各种疾病的发病机制及药物作用原理的研究。

（二）胎儿羊水静脉注射法

给家兔以1～4ml/kg体重的剂量静脉注射新鲜的胎儿羊水，可复制成急性微循环障碍动物模型。对注射动物进行活体微循环观察时发现，注射完毕时，即有血细胞流动速度减慢，毛细血管中可常见到微血流的间歇性流动，呈红白交替现象，在微静脉或较大的毛细血管中还常可见到随血流流动的透明细胞（可能为羊水细胞），20分钟后，微血流明显淤滞，局部出现凝血，微循环和较大的毛细血管中出现体积逐渐加大的白色团块，这可能是流动中的白色血栓（以羊水细胞为核心构成血栓）。注后1小时左右，大部分微血管停止流动，仅有部分微血管中可见血流缓慢移动，而且常可出现栓塞所致的突然死亡。这种急性微循环障碍动物模型的复制成功率，常随羊水的质量而异。

（三）兔脑粉浸出液静脉注射法

取新鲜兔脑粉100mg，加生理盐水5ml，50℃温箱孵育20分钟，取上清液备用。给家兔耳缘静脉推注上述溶液，剂量为1～4ml/kg体重，同时可给1/4m　CaCL₂4ml，必要时还可添加少量乳酸静脉注射。

球结膜微循环观察所见与HMWD复制的模型类似。此法最大的缺点是剂量不易控制，每个动物对兔脑粉浸出液（代替凝血酶）的敏感程度不一，用量太小，急性微循环障碍表现不显；剂量稍大，动物可发生突然死亡，必须十分注意。

第九节　皮肤病学研究中实验动物的选择与应用

一、无胸腺裸鼠的选择与应用

（一）麻风病研究

裸鼠对麻风杆菌具有高度易感性，1975年发现麻风杆菌接种于裸鼠足垫后能大量繁殖，并扩散至全身，引起瘤型麻风。以往麻风杆菌只有在背上长够九条纹的犰狳身上才能生长，而这种产于南美等地的动物难于寻找，也不易饲养和操作。现在可以在裸鼠身上接种麻风杆菌，并且生长良好，这样就给研究麻风病提供了十分有利的条件。在无特定病原体环境条件下，裸鼠能存活22个月，在这期间制作模型足以为实验室提供研究活动。有人证实大约在100到280天麻风杆菌就可播散至肝和脾，到565天，除脑之外所有器官都有瘤型浸润、足垫内含菌量高达10⁹。尽管体温很高，在内脏内还是有明显的细菌增殖，甚至在肝的实质细胞、肾和其它组织中也有。病理组织学检查结果类似人的瘤型麻风感染，这为研究麻风杆菌生理学特性、免疫原性和麻风病发病机理提供了极为有用的实验模型。裸鼠的感染能传代，有再现性，在裸鼠的足垫内接种麻风杆菌，并分别一次给0.5mg和每二周0.2mg利福平，结果类似于人一次服利福平的1500mg或者每天给600mg共二周那样的效果。从每天用利福平治疗的病人那里取来麻风杆菌接种裸鼠，结果表明仅在服用利福平450mg2天以后细菌即丧失其感染力。异烟肼、二甲胺四环素、氯洁酶素对裸鼠体内麻风杆菌无致死作用。氨苯矾对裸鼠中生长的麻风杆菌起抑制作用或抑菌作用。这些结果提示，裸鼠作为麻风化疗研究的模型有着重大的价值。

（二）皮肤移植研究

裸鼠能接受异种组织移植，包括正常的和牛皮癣皮肤。1973年Manning等在BALB/C裸鼠身上建立了人的全层包皮及其他种类的皮肤移植后能终身耐受的实验。1974年Rygarrd报告，将人的皮肤和其他种类皮肤移植到BALB/C/A/BOMF裸鼠得到成功。移植人的皮肤在6～10天期间有再生血管形成的迹象。1981年Haftek等在BALB/C裸鼠身上建立了累及牛皮癣皮肤植片的40%保持牛皮癣预期杆状变（指、趾）和典型的棘皮症。1983年Fraki等将累及和不累及牛皮癣的皮肤移植到NIH裸鼠上获得成功，累及牛皮癣的皮肤能保持其牛皮癣样的形状。

（三）黑色素瘤研究

裸鼠是人类恶性黑色素瘤适宜的动物模型，有利于人类恶性黑色素瘤的研究和治疗。黑色素瘤移植到裸鼠的成功率比较大，约50～70%。许多报导表明，黑色素瘤的生长特性和生物化学特性及其组织学变化与供者的相类似，能保留许多原来的特性，移植的肿瘤还能连续地传播，Povlsen报告能连续9年保持其生长特性。用同样药物化学治疗，其结果与临床医治病人的实践相类似。这可为人类黑色素瘤的治疗方法提出许多有效的药物和药物联合体，也为黑色素瘤的检测和免疫治疗提供了新的方法。裸鼠还可用于其他皮肤肿瘤（如基底细胞得扁平细胞癌等）的诱发、生物学特性及治疗研究。

（四）真菌感染研究

裸鼠用于真菌感染实验相当合适，特别是对新型隐球菌高度易感。1978年Graybill和Drutz在BALB/C和Swiss裸鼠上建立了新型隐球菌的致死性的感染。1979年Makoto、Miyaji等报告了经过组织病理学检查的裸鼠实验性隐性菌病，裸鼠的肝、脑、脾、淋巴结、肺和其他器官均有明显病变，又一次证明了细胞免疫在实验性隐球菌病中的作用。裸鼠作为宿主对抗真菌感染时的防御机制研究是很有用的。1978年Williams报告荚膜组织胞浆菌腹腔接种BALB/C裸鼠后，引起播散的致命感染，而杂合子鼠通常没有出现致命的感染，只有少量的荚膜组织胞浆菌繁殖生长。移植胸腺组织到裸鼠体内，可缩减严重的感染和减少大约50%的死亡率。他们提出裸鼠是荚膜组织胞浆菌感染研究有价值的模型。裸鼠的感染病包括使人遭受免疫损害的白色念珠菌感染，现已成为医学的重要研究课题。

（五）皮肤毒理学等研究

Reifenrath′s首先应用人类皮肤移植于裸鼠研究化学制剂通过人类皮肤的透入力。期待这种模型推广应用到包括化学制品在皮肤上作用的研究。裸鼠毛囊的幸存适用于毛发生长的研究。1981年Pendry等报告局部使用Cyclosporin　A药物于裸鼠口部诱发毛发生长。1977年Lynch等报告应用裸鼠研究被动皮肤过敏反应。皮脂腺、汗腺及指甲等也能用裸鼠进行研究。

二、犱狳的选择与应用

1971年Kirehheimer报告，给九带犰狳接种麻风杆菌获得成功，这是麻风病研究继1960年Shepard建立了小鼠足垫感染模型后的又一成就。接种麻风杆菌14个月后，60%以上的犱狳出现播散性瘤型麻风损害，几乎遍及全身，而且组织中含菌量极高。每克病变组织中可含麻风杆菌10⁸～10¹⁰个。因此，犰狳麻风感染模型对于麻风病的治疗、免疫学及流行病学研究都有很大的应用价值。从犰狳麻风感染组织中可以获得大量提纯的麻风杆菌，这对麻风杆菌的人工培养、生物化学和制备麻风菌苗的研究都是一个很好的来源。近年来，在美国南部陆续发现野生的九带犰狳患有原发性麻风，从这些原发性麻风犰狳分离出的分枝杆菌与实验感染犰狳的麻风杆菌无法区别。这就提示，麻风杆菌的天然宿主除人类以外，可能还有犰狳。

三、近交系小鼠和大鼠的选择与应用

（一）近交系小鼠

常选用CFW小鼠建立鼠麻风足垫感染模型。过去在筛选抗麻风药物、验证耐药菌珠、判断细菌活力、开展实验化疗等方面常被应用。在正常小鼠足垫中的麻风杆菌繁殖有限，到一定数量后即不再增加，这和正常小鼠在足垫感染后期出现对麻风杆菌的细胞免疫有关。如用胸腺摘除并经X线照射的免疫抑制鼠进行足垫接种，麻风杆菌在足垫中的对数生长期延长到接种后13个月，且菌量比正常小鼠明显增高，可达100～1000倍，以后感染可散播到耳、尾、鼻、前后足等部位。病理组织呈现偏瘤型麻风的特点。不过免疫抑制鼠死亡率高，难以进行长期的研究，不够理想。近年来，利用CFW幼鼠可建立真菌感染模型，尤其是应用于念珠菌病的诊断和治疗方法的研究，对隐性患者的早期诊断更有意义。

NZB小鼠出生后4～6个月，大多数可发生自身免疫性溶血性贫血。这种自身免疫性疾病与人的系统性红斑狼疮病变十分相似，经研究发现红斑性狼疮病变因素中的病毒介入。在淋巴样组织中查到C型RNA病毒颗粒，其T淋巴细胞也能释出病毒颗粒，也能查到抗自身T淋巴细胞的抗体，而且病理变化也基本相同。因此选用NZB小鼠是研究人类红斑狼疮性疾病极好模型动物。

（二）近交系大鼠

中国医科大学第一医院选用引自美国宾夕法尼亚大学院的Lewis(RTI^e)、Fisher(RTL1)、Buffalo(RTIb)、BN(RTIn)、及Lew1.N(RTIn)近交系大鼠进行郎格罕氏细胞Ia抗原及ATP酶的研究。

1968年郎格罕氏（Langerhans）发现，手表皮基底层上方有一种树枝形的细胞，以后被命名为郎格罕氏细胞（简称LC）。LC是一种分布较广泛，来源于骨髓，具有重要免疫学功能的细胞。

哺乳动物的某对染色体上有一区域，称为主要组织相容性复合体（简称为MHC）。小鼠的MHC称为H-2的主要分为K、I、S、G、D5个区；受K及D区基因控制的典型移植抗原存在于全部有核细胞的表面；受I区基因控制的抗原，即Ia抗原，则仅存在于某些细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、精子等。Ia抗原在各种免疫反应，如混合淋巴细胞反应，T细胞-B细胞-吞噬细胞协作反应中都极为重要。在人及其他动物的MHC内，也有相当于小鼠I的染色区域，如人的HLA-D/Dr、大鼠的RTL.B，这些相应区的基因所控制的抗原也可统称为Ia抗原或Ia样抗原。因此，在人、豚鼠、小鼠LC表面发现la抗原具有重要免疫学意义。LC在HE等普通染色切片中难以确认。曾被用于LC染色的方法很多，01、三磷酸腺苷酶（ATP酶）染色最为常用，可清楚地显示人、豚鼠及小鼠的LC。中国医科大学用抗la单抗隆抗体，以间接免疫萤光技术及间接免疫过氧化酶技术，可清楚显示成年大鼠LC的la抗原；以组织化学技术则能显示新生大鼠LC的ATP酶。这些方法可分别用于成年及新生大鼠LC的染色休检查。

四、大鼠、小鼠的选择与应用

随着免疫血清学研究的需要，目前已发展成用致敏动物含反应素抗体的血清注射到同种或密切相关的异种正常动物皮内，24～72小时后，静脉注射抗原，观察局部皮肤过敏反应，统称PCA反应。药物对各种动物PCA反应的影响是不同的。抗组织胺药对各种动物PCA反应均有抑制作用，说明各种动物PCA反应时，均有组织胺释放。但色甘酸二钠可抑制大鼠PCA反应，而对小鼠及兔PAC反应则无影响，因此，应用PAC反应来判断一个药物的抗变态反应作用时，最好不要根据一种动物PAC反应的结果。

PAC反应试验常选用的动物是大白鼠，亦用小白鼠。有时根据实验需要用兔。这些动物PAC（24～72小时）反应是由IgE介导的。豚鼠很少采用，因其PCA反应主要是由IgG介导的。

五、猪的选择与应用

1967年首次报导了辛克莱猪（Sinclair）有自发性恶性黑色素瘤，其后，在米苏里大学所选育的辛克莱的小型猪发现有很高的皮肤黑色素瘤发病率。Sinclair猪黑色素瘤模型与人类的相应肿瘤有许多共同的特点：肿瘤是自发性的；有由良性黑色素细胞病变转变为恶性能力；猪的黑色素瘤组织学上类似人的浅表扩散性黑色素瘤；转移发生于深部浸润皮肤肿瘤；转移表现与人类黑色转移的分布相似；宿主体内发生肿瘤相关性免疫反应；遗传成分十分明显，与人类某些黑色素瘤的遗传成分相当。但有些特点可区分猪与人的黑色素瘤，如白猪不发生黑色素瘤；猪肿瘤发生与紫外线照射无关；大多数病猪的肿瘤能完全消退。

Sinclair猪黑色素瘤为探讨宿主－肿瘤－细胞的相互作用上提供了独特的机会。猪黑色素瘤模型与人类恶性黑色素瘤有许多共同的特点，而且有可靠的证据说明宿主免疫因素对这一肿瘤的发生、生长及消退都有作用。同时此模型也提供了一个良好的系统，探讨从正常、癌前变化直到恶性黑色素瘤以及转移黑色素瘤的进行性细胞变化，以及黑色素瘤病变自发性消退过程中的细胞变化。因此，可以利用该模型进行黑色素癌的病理学、免疫学以及生物化学机理等方面的研究。

由于猪的皮肤与人的非常相似，包括体表毛的疏稀、表皮生长的动力学及厚度（猪30天、人21天）以及烧伤皮肤的激素和代谢修补机制等。故猪可以作为研究人类的表皮烧伤和其它皮肤损伤较为理想的模型动物。

六、其它动物的选择与应用

家犬可以自发全身性红斑狼疮疾病，国外现在研究它的遗传性病变、发病学、临床表现和诱发因子。朝鲜花栗鼠对麻风杆菌的易感性比较高，麻风杆菌能在接种的组织中繁殖，并出现特征性的麻风病变。近年来，德国及英国均曾用欧洲刺猬进行麻风杆菌接种试验，建立麻风病变模型，国内已有单位开展这项研究工作。

豚鼠是研究实验性接触性变态反应的常用实验动物，并为研究接触性变态反应的最佳动物。豚鼠易于致敏。其发生的变态反应性接触性皮炎（ACD）与人类十分相似。然而豚鼠躯干部表皮层较薄（仅4层细胞），发生的病理变化与人类也有差异，如不易发生水疱等。而乳晕部表皮较厚，层次基本与人类表皮相当，且无毛，便于标本制作和观察。如常选用白色雌性豚鼠，体重400～500克，进行实验性接触性变态反应中郎格罕氏细胞的动态观察研究。

第十节　病毒学研究中实验动物的选择与应用

一、病毒学研究中实验动物的选择

病毒学研究常选用的实验动物有金黄地鼠、小白鼠、豚鼠、家兔、绵羊、禽类、猴等。分离病毒广泛使用的是乳鼠，它对柯萨基病毒、呼吸道肠道病毒和虫媒病毒感染有高度易感性。许多柯萨基病毒A型直到目前仍然不能在1月龄小白鼠以外的任何非人的宿主中培养。因此，目前研究虫媒病毒常选用小白鼠乳鼠及刚断乳的幼鼠，A型柯萨基病毒需用出生一天内的小白鼠培养。用感染乳鼠脑制备补体结合抗原，滴度常较高且非特异性仅应较少。

其他实验动物，如成年小白鼠、兔、豚鼠、雪貂在人类病毒学的发展史上曾起过关键性作用，但目前它们主要用来研究病理机制、制备诊断用品等，并不用于分离病毒。灵长类动物广泛用于致病性研究，特别是可能由“慢病毒”感染引起的一些疾病。

选用作病毒学研究的实验动物，应首先考虑采用该病毒的易感动物。不同病毒的易感动物与接种途径见表10-48。

表10-48　各种病毒常用易感动物与接种途径

病毒	实验动物		接种途径
单纯疮疹	家兔 豚鼠		角膜、脑内 肉趾
痘苗、天花	家兔 犊牛 恒河猴等		角膜、睾丸 皮肤 皮肤、角膜、呼吸道
水痘	恒河猴等 家兔		脑内、睾丸 睾丸、眼前房
鼠痘	小白鼠 豚鼠、地鼠		皮肤、皮下、肌肉、腹腔、脑内 皮肤
脊髓灰质炎	各种猴 棉鼠 小白鼠 金黄地鼠	兰辛株Ⅱ型	脑内、鼻内、腹腔 脑内、扁桃腺、腹腔 脑内、脊椎内 脑内
柯萨基、甲型 风疹	初生小白鼠 乳小白鼠 雪貂		脑内、肌肉、腹腔、皮下 皮下、腹腔、鼻腔、静脉 皮下、脑内
口蹄疫	幼龄豚鼠 乳小白鼠		足趾 脑内
狂犬病	家兔 小白鼠、地鼠、大白鼠、犬 猫、鸡、猴		脑内、皮下 脑内
水泡性口膜炎	豚鼠 小牛		足趾 舌粘膜
流感	雪貂 小白鼠（传代适用、甲、乙型） 猴		鼻内 鼻内 鼻内
猪流感	小白鼠 雪貂		鼻内 鼻内
腮腺炎	恒河猴等		脑内、腹腔、静脉、腮腺
麻疹	恒河猴（部分可用豚鼠、家兔）		皮下、肌肉、静脉、脑内、脑腔
新城疫	鸽、鸭、鸡、鹅、燕、麻雀		脑内、鼻内、神经外
乙型脑炎	小白鼠 恒河猴		脑内、腹腔、皮下 脑内、鼻内、皮下
春夏型脑炎	小白鼠 绵羊 恒河猴		脑内、腹腔、静脉、皮下 脑内 脑内
登革热	恒河猴等 小白鼠乳幼鼠（传代适应）		脑内 脑内
马脑脊髓炎（各型）	小白鼠 豚鼠 家兔		脑内 脑内 脑内
羊跳跃病	小白鼠 大白鼠 地鼠		脑内、腹腔、鼻内 脑内 脑内

在进行肿瘤病毒研究时要注射选择病毒的自然宿主和实验宿主动物。因为病毒与肿瘤关系主要来源于实验动物的研究，实验动物的选择很重要。动物肿瘤病毒因所含核酸不同而分为两类，即RNA肿瘤病毒和DNA肿瘤病毒。RNA肿瘤病毒有三种电镜形态，称为A型、B型和C型。最常见的为C型颗粒。DNA病毒中，有多种能引起动物肿瘤。其大小不一，最大的病毒如痘病毒、疱疹病毒、传染性软疣病毒，最小的病毒如多瘤病毒。动物DNA、RNA肿瘤病毒的自然宿主和实验宿主情况见表10-49和表10-50。

表10-49　动物RNA肿瘤病毒

病毒组	肿瘤	简称	自然 宿主	自然肿瘤发生	实验宿主		病毒形态
机体					细胞
鸟病毒组	白血病 肉瘤	ALV RSV	鸡 鸡	+ +	鸡、火鸡 鸟、猴、啮	鸡 鸡、啮、牛、猴、人	C C
小鼠病毒组	白血病 肉瘤 乳腺癌	MULV MSV MTV	小白鼠 小白鼠 小白鼠	+ - +	小鼠、大鼠、地鼠 同 -	- 小鼠、大鼠、地鼠 -	C C B
猫病毒组	白血病 肉瘤	EeSV FeSV	猫 猫	+ +	猫 猫、狗、兔、猴	猫、狗、猴、人	C C
其它	蛇 地鼠白血病 大鼠白血病 豚鼠白血病 牛淋巴瘤 猴肉瘤 猴乳腺癌	- llaLV RaLV - - - -	蛇 地鼠 大白鼠 豚鼠 牛 猴猿 猴	+ - - - + +	- - - - - 猴	- - - - - 猴	C C C C C C B

表10-50　动物DAN肿瘤病毒

病 毒 组	宿主	自然肿瘤	实验宿主		大小（毫微米）	结构	成熟部位	瘤细胞中成病毒
机体			细胞转化
乳多空病毒组	乳头瘤病毒 多瘤病毒 SV40	人、牛兔、狗 牛、鼠 猴	有 无 无	人、兔、牛、狗 小鼠、地鼠 地鼠	小鼠、大鼠、地鼠 小鼠、地鼠、人	40-55 40-55 40-55	20面体对称 20面体对称 20面体对称	核 核 核	有 无 无
腺病毒组	人引型 猴6型 牛 鸟型	人 猴 牛 鸡	无 无 无 无	小鼠、大鼠、地鼠 小鼠、大鼠、地鼠 小鼠、大鼠、地鼠 小鼠、大鼠、地鼠	大鼠、地鼠、人 大鼠、地鼠、人 大鼠、地鼠、人 大鼠、地鼠、人	70-80 70-80 70-80 70-80	20面体对称 20面体对称 20面体对称 20面体对称	核 核 核 核	无 无 无
疱疹病毒组	HSV2 EBC 猴 鸟 蛙 兔	人 人 猴 鸡 蛙 兔	？ ？ 无 有 有 无	地鼠 猴 鸡 蛙 兔	地鼠、人 人	100 100 100 100 100 100	20面体对称 20面体对称 20面体对称 20面体对称 20面体对称 20面体对称	核 核 核 核 核 核	无 无 无 无 无 无
痘病毒组	传染性软疣 YaBa 纤维粘液瘤	人 猴 兔鹿松鼠	有 有 有

二、常见病毒敏感动物的选择

病毒敏感动物的研究，一直是病毒学中的重要内容之一。实验动物在人类病毒学发展史上曾起过重要作用，主要用作分离病毒、研究发病机制、抗病毒药物筛选、疫苗效果及完全性鉴定、制备诊断用品等。

实验动物选择，应注意影响动物实验效果的各种因素。不同种属动物对同一致病因素的易感性不同，对一种动物是病原体，对另一动物可能并不致病。即使是同一种属动物的不同品系，对同一刺激的反应也有很大差异。年龄、体重、性别、生理状态、健康情况，往往导致对同一刺激的不同结果。此外，病毒学研究中，接种途径的改变往往导致不同的感染结果。实验中，应尽量利用经微生物控制的动物和纯种动物。

表10-51　各种病毒在鸡胚内的繁殖与接种途径

病　毒	鸡胚 日龄（天）	接种途径	培养 温度（℃）	培养时间	繁　殖	收　获
流行性感冒	9～12	尿囊腔、羊膜腔	33～35	36～48小时	血　凝	尿囊液、羊水
流行性腮腺炎	9～12	″　″	35	5～7天	血　凝	″　″
新城疫	9～12	绒毛尿囊膜、羊膜腔	32	4天	死亡血凝	″绒毛尿囊膜
水　痘	10～13	绒毛尿囊膜	37	2～3天	痘　疱	绒毛尿囊膜
痘　苗	10～12	″	37	2～3天	痘疱死亡	″
天　花	10～12	″	37	3天	″　″	″
单纯疱疹	10～13	″	37	2～6天	″	″
带状疱疹	10～13	″	37	2～5天	″　″	″
乙型脑炎	6～8	卵黄囊、绒毛尿囊膜	37	3天	死　亡	鸡胚、尿囊液、绒毛尿囊膜
春夏型脑炎	6～8	″　″	37	3～4天	″	卵黄囊膜
东方马脑炎	10～12	羊膜腔、尿囊腔	37	18小时	死　亡	尿囊液、羊水、绒毛尿囊膜
淋巴球性 脉络丛脑膜炎	6～8	绒毛尿囊膜	37	3天	″	绒毛尿囊膜
狂犬病	7～9	″　羊膜腔	37	4～6天	血　凝	″、羊水
劳斯肉瘤	9～11	″	37	5～10天	痘　疱	绒毛尿囊膜
鸡传染性支气	5～6	卵黄囊	37	3～4天	死亡或异常	卵黄囊
管　炎	9～11	绒毛尿囊膜	37	3～7天	″　″	尿囊液、绒毛尿囊膜

（一）RNA病毒敏感动物

1．披盖病毒科

⑴黄热病毒：黄热病毒是披盖病毒科、黄热病毒属（B组虫媒病毒）的原型。所有灵长类可能都易感，其中非洲种类抵抗力较高，只有隐性感染或很轻的非致死症状，而南美及西印度群岛的猴敏感得多。最为敏感的动物是恒河猴，另外可用中国猴（Macacus　Sinicus）及断尾猴（M.Speciosus　Thibetanus）。小白鼠对黄热病毒也敏感，令人感兴趣的是：纯血清接种的小白鼠尚能很好存活，而以稀释血清接种的小白鼠却于较短时期内死亡。这一奇特现象的理由，可能是由于病人体内血清抗体早期出现之故。应用纯血清时，这些抗体中和了病毒的作用，而当应用稀释的血清时，抗体浓度不足，但病毒在稀释后仍然具有活力。

⑵登革病毒：登革病毒属披盖病毒科中的黄病毒属，小白鼠往往是经常应用唯一实验动物。有几株病毒已对其适应，特别是对新生小白鼠。1～2日龄乳鼠和仓鼠脑内注射病毒后死亡。病毒对小白鼠的适应过程如下：接种年龄2～3周的小白鼠，最好选用abc种，一部分小白鼠接受未经稀释的血清，另一部分则接受稀释至1：100的血清，观察5～6周，杀死明显有麻痹或脑膜炎征象的小白鼠，以其脑组织制或悬液接种于其人它小白鼠。

猴对登革病毒易感，很多种猕猴，食蟹猴，长尾猿，狒狒都可因蚊虫叮刺或注射病毒而受到感染。基本是无症状的隐性感染，但接种后1～7天内有病毒血症，有人报告有轻度白细胞减少。

小鸡、晰蜴、新生或成年豚鼠、兔、仓鼠或棉鼠实验接种后不发生疾病。

个别报告称脑内或鼻腔内接种可使日本黄鼠死亡，未能被证实。

⑶乙脑病毒：乙脑病毒属于披盖病毒科黄热病毒属的B组虫蝶病毒。

实验室内，乳鼠和成年小鼠鼠脑内接种后发生致死性脑炎，腹腔内接种后乳鼠发生致死性脑炎，只有几种小鼠株的成年小鼠发生致死性脑炎。恒河猴、食蟹猴和成年仓鼠脑内接种后发生致死性脑炎，但周围途径接种时只发生无症状的病毒血症。豚鼠和兔脑内或周围接种，蝙蝠、小鸡、和苍鹭周围接种后都只发生无症状的病毒血症。蝙蝠可保持感染，经过冬眠后重新发生病毒血症。

2．沙粒病毒科

⑴胡宁（Juinin）病毒：胡宁病毒是阿根延出血热致病因子。属子沙料病毒的Tacaribe复合群。

豚鼠实验感染Junin病毒时产生类似人类阿根延出血热的致死性疾病。接种后5～8天，感染的动物开始发热，在11～15天体温过低，休克而死亡。病毒血症以及尿和唾液排出病毒一直到死。尸检时采集的主要器官中都有病毒。

乳鼠实验感染时产生典型的病毒性脑炎，死亡率为95～100%，成年小鼠有抵抗力。

⑵拉沙（Lassa）病毒：拉沙病毒属于沙粒病毒科。新生小白鼠脑内接种此病毒引起不显性持续感染。成年小鼠脑内接种后5-7天出现致死性疾病，有痉挛发作，最后后腿强直、呼吸停止。成年多乳鼠实验感染为隐性感染。松鼠猴肌肉接种后，经10-14天潜伏期，动物发生多变的致死性疾病。豚鼠腹腔内接种后，发生呼吸功能不全，约67%的动物死亡。

⑶淋巴细胞脉络丛脑膜炎（LCM）病毒：本病毒与拉沙病毒，马秋堡（Machupo）病毒同属沙粒病毒属，对小白鼠脑内接种尤为敏感，可供分离病毒用，对猴及豚鼠有致病力。

应使用4周龄的小鼠及乳鼠、未断乳豚鼠200-400g重的豚鼠。可能时，采用“瑞士”Albinos种小鼠。饲养中，应确保无LCM病毒感染。为取得最好效果，一方面接种幼年动物，另一方面用年龄较长的。接种量如下：

6-8天龄乳鼠：脑内接种0.03ml，腹腔接种0.2ml。

4周龄小鼠：脑内接种0.03ml，腹腔接种0.25ml。

未断乳的小鼠：脑内接种0.05ml，腹腔接种1ml。

已断乳的200-400g豚鼠，脑内接种0.15ml，腹腔接种5ml。

不同接种途径的感受性亦是不同的。脑内接种感染而发病的鼠数（4周龄以上的）远比经腹腔内接种者为多。经腹腔接种者可不显任何症状。豚鼠（250g以上）二种接种途径的发病数大致相等（有进脑内接种稍高些），但这些资料并不对所有毒株适用。

小白鼠感染后表现多变，可能有三种过程：⑴急性疾病并死亡；⑵急性急病，恢复并产生抗体；⑶形成持久的耐受性感染，携带病毒，不产生抗体。决定因素有：⑴感染的病毒株；⑵接种途径（最为重要）；⑶动物感染时的年龄。

产生急性疾病的动物一般在感染后4-7天出现体征。表现为：弓背、竖毛、嗜睡、眼睑炎、头部水肿等。

3．小RNA病毒科

⑴脊髓灰质炎病毒：脊髓灰质炎病毒是小核糖核酸（RNA）病毒科、肠道病毒属的一种。1908年Landsteiner和Popper成功的把此病毒传播于猴。在后来的40年里证明了亚人类灵长类能经消化道感染，有些株能适应于实验室的啮齿类。

猴子：在此属内，猩猩能感染和人类完全相似的疾病。但此类动物不易常备。实际工作中，各种不同的猕猴对本病来说是猿类中最为优良的品种，特别是Macacus　Rhesus。长尾猴类以及狒狒类对脊髓灰质病毒亦有感受性，唯敏感性远较猕猴为差。接种方法很多，脑内注射未必是最佳的，可用：腹腔注射、坐骨神经附近的深部肌肉注射、鼻腔滴注。实验操作中最好以不同方法混合接种。

啮齿动物：病毒在应用啮齿动物前，常需经猿子适用1-2代。啮齿动物（棉鼠、小白鼠、田鼠、鼷鼠）可经脑内接种，最好选用年幼动物、2-3周龄的小白鼠或15天龄的棉鼠。动物常于12-25天出现麻痹。

⑵柯萨基（Coxsackie）病毒：柯萨基病毒属小RNA病毒科肠道病毒属。根据本病毒对乳鼠的致病情况将其分为两组：A组：产生弥漫性肌炎伴有随意肌纤维的急性炎症及坏死。B组：主要引起大脑局部退行性变等。

柯萨基病毒常用的传代和分离方法，是乳鼠脑内、腹腔内或皮下接种。4-5日龄的小鼠对A组病毒的感染仍然敏感。但B组病毒在1日龄或更小的小鼠繁殖最好。即使是成鼠，给予注射可的松、X线照射或感染期间持续暴露于寒冷（4℃，B组病毒）或严重营养不良都可使其对柯萨基病毒易感。通常乳鼠在症状出现后24小时内死亡。除乳鼠外亦可用3周龄以内的鼷鼠（Merion），它有固定的感受性，可用以分离及传代。恒河猴脑内接种A₇和A₁₄病毒引起中枢神经系的神经节细胞广泛变性，进而导致松弛性麻痹。

4．布尼雅病毒科

肾综合症出血热病毒（HFRSV）属于布尼雅病毒科、布尼雅病毒属，其敏感动物详述于后。

5．正粘病毒科

流感病毒：属于正粘液病毒属。动物模型最好用雪貂，也可用小白鼠、金黄地鼠、豚鼠、猴及猪。

雪貂：是较为理想的交流感动物模型。白色皮毛的雪貂似较杂色雪貂为敏感。病理材料经鼻腔内接种。雪貂对甲、乙型流感均易感，病毒不经适应即能对雪貂致病，并易传播给其它雪貂和人。其临床表现与人相似，发热，并伴上呼吸道感染。愈后血清中产生高滴度抗体。

小白鼠：对流感病毒敏感。但其症状与人不同，主要表现为下呼吸道感染，并死于肺炎。直接取自患者的材料不宜于小白鼠分离病毒。适用的方法是：有毒材料应①在乙醚麻醉下通过鼻腔接种，②先在雪貂身上适应。

金黄地鼠：地鼠对研究流感温度敏感变异株很有用处。地鼠为隐性感染，但可在鼻、肺部测出病毒繁殖量。有利之处是：其体温和鼻部温度与人的相似。对人毒不同的流感病毒温度变异株，在地鼠机体也表现出相似的差异。

6．副粘病毒科

⑴麻疹病毒：除灵长类外，一般动物均不易感。1911年首次成功地传给猕猴。以后证明，除了接触和吸入外，其它种类的猴，如：猿类、恒河猴、崇猴、爪哇猴、倭猴等，对各种不同接种途径也易感。其症状类似人类麻疹。潜伏期为3-22天，病毒血症期为4-15天，约一半动物有皮疹、结膜炎、卡它和发热。

适应在组织培养上的病毒可在乳腺或乳地鼠体内繁殖，脑内接种可引起脑膜炎症。

⑵呼吸道合胞病毒：猩猩感染后可产生与人一样的上呼吸道临床症状。

猴，Cebus猴感染本病毒后，可引起肺炎。在肺和支气管都可以找到呼吸道合胞病毒抗原。Cebus猴感染后4-6天，病毒繁殖方可达高峰，并出现临床症状。

雪貂年龄愈小，病毒繁殖量愈大。3日龄雪貂，鼻内感染时其肺部病毒量可达105PFV/g肺组织，7-14龄雪貂，肺病毒量仅103-104PFV/g肺组织；28日龄的雪貂，其肺内测不出病毒繁殖量。

此外，地鼠和棉鼠对呼吸道合胞病毒较敏感，感染后，在其细支气管及肺可以找到呼吸道合胞病毒。

7．弹状病毒科

狂犬病毒（Rabies　Virus）：1987年Galfiev　首先用家兔作为实验动物，进行了传统的实验，在该实验中，巴斯德培育了对犬致病力减弱而对家兔具有固定潜伏期的病毒。

为了建立实验室感染，常选用：中国地鼠、小白鼠、豚鼠和兔（按敏感性程度排列）。颅内接种比皮下或肌肉注射更可靠。

小白鼠的狂犬病毒伏期一般为8-14天，很少超过20天。表现为竖毛、弓背、活跃兴奋或淡漠无力，进而战栗，后肢瘫痪，死亡。

家兔：初始症状为瞳孔扩张，数小时后呼吸困难、瘫痪，潜伏期一般为12-25天。

豚鼠：潜伏期比家兔短，当发生症状后，常有兴奋期，此时，动物变得凶暴，最后瘫痪。

（二）常见DNA病毒的敏感动物

1．痘病毒科

天花病毒：猴及家兔均敏感。应选用雄兔作皮肤划痕接种、角膜划痕接种、睾丸内接种。猴子则在胁腹部皮肤上作划痕接种，如系雄猴则同时作睾丸内接种。感染后兔皮肤上出现明显的皮疹，局限于皮肤划痕处；角膜炎性轻微或缺如，无睾丸炎。猴沿皮肤划痕出现典型皮疹，如做睾丸内接种，则有睾丸炎发生。

2．疹病毒科

⑴单纯疱疹病毒（HSV）：家兔为最适宜的动物，豚鼠、小白鼠、地鼠亦可用。用家兔及豚鼠的原因之一，是因为可以用有菌材料做角膜接种而可不加抗菌素或过滤，不妨碍病毒生长。

家兔角膜途径接种：导致角膜结合膜炎。脑内途径接种：出现脑炎症状，最后死亡。

豚鼠角膜接种：病损如家兔。脑内接种：有发热，偶而有脑炎症状。

皮肤接种：最好在足蹠皮内作划痕，皮肤可出现皮疹，最后可能死亡。

小白鼠：最好用新生小鼠。经脑内或腹腔接种。动物呈脑炎症状，最后死亡。亦可同时接种一批“病毒－抗疱疹标准血清”混合液，以观察第一批动物死亡及第二批动物存活情况，以签定病毒。

⑵水痘一带状痘疹病毒（VZV）、巨细胞病毒：还未发现有实验动物对这两种病毒敏感。

（三）未分类病毒的敏感动物

1．甲型肝为病毒（HAV）

1967年Deinhardt等首次证明HAV可在狨猴体内增殖，此后Mascoli等从狨猴体内发现人类HAVCR326株。

狨猴、黑猩猩、红面猴对HAV均易感，经口或静脉注射接种病毒后，可产生肝炎。

肝组织呈现肝炎的病理改变。细胞浆内查到HAV抗原，恢复期血清中检测出相应抗体，粪便中可排出HAV颗粒。

2．乙型肝炎病毒（HBV）

黑猩猩是HBV的易感动物。狨猴虽可感染但不如前者敏感。因此用黑猩猩研究HBV的发病机理、检测自动免疫、被动免疫的效果以及HBV疫苗的安全性。

目前为止，各种病毒敏感动物的研究。仍然是病毒学中引人瞩目的的领域，因为在不同病毒疾病发病机制的研究、抗病毒药物筛选、疫苗效果及安全性鉴定等方面，动物模型都有其独特的优越性。但就病毒分离而方，使用组织培养的方法，对于某些病毒更为方便。不同实验室可根据其实验目的、动物来源情况等，选择不同的敏感动物。

三、HFRS动物模型的研究和应用

肾综合征出血热病毒（HFRSV），属布尼亚病毒科（Bungavividae）中的一个新属，称为汉坦病毒属。自1978年南朝鲜李镐汪首次以疫区黑线姬鼠肺分离到HFRSV（亦称汉坦病毒Hantaan　Virus,HTNV）后，对其动物模型进行了众多的研究。

（一）HFRS感染动物模型

感染动物模型的亚临床感染，亦无明显病理变化，主要用于病毒分离和传代。目前有：非疫区黑线姬鼠、大白鼠、长爪沙鼠、家兔等。

1．黑线姬鼠

非疫区黑线姬鼠是最早用于病毒分离和实验研究的动物。据报道用各种途径（肌肉、皮下、肺内、鼻内、或经口）接种均可使黑线姬鼠感染。皮下和肺内接种0.1ml汉坦病毒或待检其其它材料后，10天左右肺部出现病毒，以后在肾、肝、颌下腺中可检出病毒。约接种后20天，肺中病毒滴度最高，以后逐渐下降，但150天后仍可检出。

黑线姬鼠为野生鼠类，常有野生啮齿类病毒的污染，加之来源、人工饲养、繁殖等问题较难解决，因而使用受到一定限制。

2．大鼠成鼠

1981年Leepw等将朝鲜出血热病毒接种到雌性、1月龄Wistar和Fisher大鼠。这是首次将该病毒接种于实验大鼠，肌肉接种0.5ml汉坦病毒后14-65天，肺内可发现其特异性抗原；接种后三周，血清中可检出特异性抗体，除脾脏亦可查到特异抗原外，与黑线姬鼠脏器的抗原分布相同。

朝鲜出血热病毒对实验室大鼠的适应，提供了无野生啮齿类病毒污染的实验模型。现已应用于特异性药物治疗研究。

3．长爪沙鼠成鼠

1983年朱智勇等发现长爪沙鼠对HFRSV敏感。六种途径（肺内、皮下、腹腔、口腔、肌肉）接种，第1代即可感染，无需传代适应；脏器内检出特异性荧光部位与黑线姬鼠相同。接种病毒后4天，肺组织中查见病毒抗原，5-7天过高峰，通常于10-14天消失。接种后8天，查到抗体，14天达高峰。长爪沙鼠可用多种宿主动物体内HFRSV的分离，且在较短时间内即可获得毒株。而且，这些毒株可用于疫苗的研制。

4．家兔

HFRSV感染的家兔，与长爪沙鼠成鼠一样，亦为无症状短期自限性隐性感染。不同来源的HFRSV，除口饲外，肌肉、腹腔、肺内、皮下接种均可使家兔感染，并能在体内连续稳定地传代，但不表现任何症状。接种后4天，有持续数天的病毒血症，7-14天可在多种器官内找到病毒抗原，以脾、小肠、胰腺中为明显，肺、肝、肾等组织内偶尔可见，8-9天抗原量最多，同时在血液中开始查到相应抗体，随抗体效价增长体内病毒抗原很快减弱，至第15天完全消失。

初步实验表明，R3和76/118株都能使乳兔感染，其表现与成兔相似，全身多种脏器组织内可检出病毒抗原，但其荧光亮度更强，提示乳兔对HFRSV更敏感。

（二）HFRS致病动物模型

致病动物模型为显性感性甚至死亡，并伴有明显病理改变。主要用于发病机理研究、药物筛选等。目前有小白鼠乳鼠、大鼠乳鼠、裸鼠及环磷酰胺处理的金黄地鼠。

1．小鼠乳鼠

Tasi等报道了第一个致病动物模型，即新生小白鼠（2-4龄）。相继发现CD-1、ICR、Balb/等品系乳鼠均对HFRSV敏感。颅内、腹腔、肌肉、皮下接种均可使其感染。我们的研究发现：颅内、腹腔联合接种与单纯颅内接种，在发病时间、抗原分布上无明显差别。但腹腔接种乳鼠发病时间要比脑腹联合接种及单纯脑内接种平均迟4-5天。病毒抗原广泛分布各脏器（脑、心、肝、脾、肺、肾、胸腺），脑内接种0.02ml经乳鼠传代适应的汉坦病毒76/118株（LD50、10-6·5/0.02ml），乳鼠第7天开始发病，表现为蜷缩、活动减少、耸毛、弓背、尾强直、后肢麻痹，直致死亡，发病规律。

乳鼠现已成功地用于病毒分离、繁殖高滴度HFRSV，并被用于研究不同来源毒株的毒力及测定疫苗效力和安全性、筛选抗病毒药物及研究发病原理。

2．大鼠乳鼠

Fishet大鼠（E344/N）出生后24小时内，分别颅内接种HFRSV76/118株和B-1株（分离自实验室大鼠），死亡率分别为18.8%、42.9％。腹腔分别接种上述两种毒株，观察至第50天，仍未见死亡。

3．金黄地鼠

每只地鼠腹腔一次注射200mg/kg环磷酰胺，48小时后，腹腔或皮下注射病毒悬液1ml，或脑内接种0.05ml。绝大多数动物在感染后7-9天病死。在病死地鼠的各器官均发现有HFRS病毒抗原，并分离到病毒。各器官的病理变化酷似人体出血热病变。

4．裸鼠

14-42天龄的CK-1无胸腺裸鼠，脑内接种104·4PFU（0.02ml）汉坦病毒76/118株后40天，表现有体重减轻、活动减少、站立不稳、嗜睡等，最后全部死亡。而其同龄同窝兔功能正常鼠不发病。

我们用乳鼠适应的汉坦病毒76/118株感染了21日龄NIH品系的无胸腺裸鼠，感染剂量2.5×10⁵LD₅₀，（脑腹联合接种，0.02ml/脑，0.05ml/腹）。最早于第8天开始发病，表现为活动减少、互相抱团、食欲减退、体重减少、弓背、后肢麻痹，于20天内全部死亡。而接种相同量病毒的同窝免疫功能正常鼠则不发病。脑、心、肝、脾、肺、肾均有特异抗原，脑内抗原荧光最亮。初步观察了人白细胞干扰素对裸鼠感染的保护作用，剂量为：20×10⁶μ/kg，腹腔内给药，自病毒感染当天开始，连续用药6天，发现治疗组比对照组存活时间延长1.5-3天，进一步的研究正在进行中。

（三）灵长类和树鼩

灵长类的研究尚无肯定的结果。

非洲绿猴、脑内接种HFRSV后，观察7周，未见临床症状及病理变化。Amyx等发现猕猴和黑猩猩接种后，可有规律地出现短暂蛋白尿、病毒血症，偶见痰质血症。在日本，用HFRS病毒接种幼龄猕猴（Ｃynomolgus）后７周，可见有与HFRS病人相似的病理变化：肾、肺、脾、心脏和肝可见毛细血管扩张、部分脏器可见弥漫性血管内凝血（DIC）、肾髓质集合管退行性变、感染3-4周有蛋白尿，并在组织中检出抗原，但未观察到临床症状。看来猕猴可能有希望做为较好的致病研究模型。

国内未志勇等将R₃株病毒接种三只恒河猴（3～4岁），研究HFRS病毒在猴体内的分布、增殖和排出，研究结果表明，接种病毒后3～5天即出现病毒血症，直至血液中检出抗体前2天止，持续8天之久；猴产生抗HFRS抗体时间在接种后第14天，且IgG和IgM抗体同时出现；病毒血症期直至产生抗体上，猴体内各器官组织未发现病毒增殖。此时粪便和尿都未分离出HFRS病毒。从而可推测HFRS病毒在猴体内增殖的部位可能是循环血细胞内，这与近年来证明该病毒在病人血细胞内增殖相符。

最近严玉辰等将A16株病毒接种于六只树鼩，每只由皮下和脑内混合接种10^-1病毒悬液1ml。结果：1～2号树鼩于接种后7天死亡，经检测脏器抗原皆阴性，死后查血清抗体阳性。3～6号树鼩接种病毒后，经2～4次尿抗体检查均阴性，血清抗体皆阳性。接种病毒7天后，均有不同程度的体温增高现象。其中5号树鼩于接种病毒在9天死亡。抗原在树鼩脏器组织中的分布颇为广泛，但1～2号小兽血中有抗体，脏器内未检出抗原，何种原因尚待研究。初步看来此种小兽对HFRS病毒较敏感，但非理想的敏感动物。其不同年龄、不同毒株、不同剂量的实验，有待进一步深入研究。（本节常见病毒敏感动物的选择资料由王晶翼同志提供）。

第十一节　老年病研究中实验动物的选择与应用

随着社会的发展、经济卫生状况的改善和科学技术的日益进步，人类的平均寿命亦越来越长，老年人在总人口中的比例不断增加。据联合国估计1975年全世界老年人约有3.5亿，预计到2000年将产加到5.9亿。目前有些发达国家老年人口已占总人口的15%，甚至更多。发展中国家老年人口虽然一般为10%左右，但老年人口比总人口的增长更快。因此老年病研究已成为生物医学研究的重要课题。

老年病研究中，对实验动物来说，应重点解决建立研究人类的老化用实验动物模型；积累各种实验动物的正确而详细的生物学资料；供应为老化研究用的实验动物，特别是老龄实验动物。

一、老年病研究中实验动物的选择

目前，用于老年医学研究的实验动物以哺乳类动物为主体，有小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猪、猴等，其中大鼠使用最多，并广泛用于各种项目的研究，其中以细胞生化学、消化器、激素、酶等研究为主。小鼠的使用数虽比大鼠低，但用途广泛，以放射线、消化器、免疫、酶等的研究为主。鸟类的使用率不高，但涉及的研究项目地很广。鱼类、两栖类、爬虫类以及无脊椎动物等，绝大多数被用于比较生物学的研究。对各研究项目每年所使用的实验动物种类进行了调查，结果发现在DNA、染色体、放射线、细胞生化学、培养细胞、脑神经、循环器、肾脏、呼吸器、消化器、内分泌、运动器、皮肤、感觉器、结缔组织、RNA等众多研究项目中，大鼠、小鼠的使用量最高；而在糖质、脂质、胶原和免疫研究项目中，小鼠的使用率比大鼠高，大比较生物学的研究中，所有的动物的使用数量差不多。

非哺乳类动物在老年医学研究中也被选用，如果蝇、沙蚤、蚯蚓、轮虫、线虫、水螅、原虫等。天津医学院老年实验室推荐以果蝇做为老年学实验动物模型较为适宜，果蝇的生存期短、繁殖快、高度纯种、饲养管理简便，他们还介绍了一些饲养果蝇的配方经验以及果蝇筛选抗衰老药物快速定性的方法。

老年医学研究中实验动物选择应注意下面几个问题。

（一）老年学实验研究中实验动物的选择原则

1．有明确的生命期限，确知使用时的寿命；

2．具有与人类相似的生长发育、繁殖和衰老的生命阶段；

3．对感染和传染病有一定的抵抗能力；

4．食物内容和营养条件与人类相似；

5．能够施行多种检测指标进行检验；

6．染色体的分析方便易行；

7．饲养管理简便，价格经济。

（二）应注意实验动物的寿命和各种动物间寿命的相应时间

人的寿命较一般实验动物的寿命要长得多，对人体的老化研究，须进行长达70年的现象分析，无疑，采用寿命短的实验动物进行研究是有用的。但象大鼠、小鼠寿命较短，仅2～3年，与人老化过程相比有较大差异，在分析老化本质时应当谨慎。在人工致癌使用大鼠和猴时，达到致癌期需10～12个月时间，对大鼠来说，已占其生命的一半时间，而对猴仅是生命的1/10～1/20。在分析老化和致癌的机制关系上，必须充分考虑。

因此老化研究中选择实验动物时应注意各种动物间寿命的相应时间。如一般人以60岁为老年年龄，则其他几种常用实验动物进入老年的相应时间分别为：猴13.5年，狗10年，豚鼠4.8年，大鼠1.7年，小鼠1.3年。

常用实验动物寿命的相应时间和生命过程的某些参考值可见图10-14和表10-52。

图10-14各种动物平均寿命的相应时期↓符号表示动物的成年时期

（此自实验动物かちヒトへの）（狗是Beagle种）

表10-52　人和实验动物生命过程的某些参考值（按田鸡等经修改补充）

种　类	妊　娠　期	哺　乳　期	性　成　熟	寿　命
人	280天		13.5年	70年
猕　猴	170天	3个月	♂45，♀3.5年	20年
狗	63天	1个月稍多	6个月	15年
猫	57～63天	1个月稍多	7个月	10年
家　兔	30～32天	43	7.2个月	7～8年
豚　鼠	60～72天	15天	♂60～70，♀40～50天	6～7年
金黄地鼠	15～18天	15～20天	5-8周
大　鼠	18～22天	20～25天	♂60～80，♀50～80天	2～3年
小　鼠	18～22天	17～21天	40～50天	2～3年
猪	114天	30天	8.5个月	16年
山　羊	152	30天	6～7个月	8～10年
绵　羊	149天	30天	6～7个月	10～15年

老龄实验动物可依据动物的牙齿磨损程度、外形颜色、指爪长度及厚度、眼睛的朦胧程度、毛色色泽、行动迟缓程度等来判定。如老龄狗的牙根全部磨损、牙齿发黄；老龄兔门齿厚长而暗黄，时有磨损，眼睛朦胧，行动迟缓，被毛无光泽。雌性大鼠和小鼠可检查其阴道涂片的细胞学变化，如连续检查三个动情周期均无规律性的细胞学变化，即表示其已进入老龄。

（三）应注意选择标准化的实验动物

在进行老年医学研究中应充分考虑所用实验动物的生物学状态，即遗传基因型、表现型、演出型。应尽量选择经遗传检测、微生物检测、营养检测、环境检测的合格的标准化实验动物。最常被选用的是各种品系的小鼠和大鼠。在选用时应了解各品系小鼠或大鼠的生物学特性和寿命期限。不同品系小鼠的平均寿命见表10-53。

表10-53　不同品系小鼠的平均寿命（天）

品　系	雄			雌
	动物数寿命　（天）　（SE）	动物数寿命　（天）　+　（SE）
A	68	558	(19.7)	65	512	(21.1)
AKR	79	312	(9.7)	79	350	(10.8)
A2G	51	644	(19.4)	49	640	(21.8)
BALB/C	33	561	(30.3)	35	509	(26.3)
CBA	38	825	(32.5)	37	486	(39.0)
CE	23	707	(37.3)	20	489	(48.5)
C3H	193	676	(9.8)	147	590	(18.6)
C57BL	29	580	(35.8)	31	645	(34.2)
C57BR/Cd	46	660	(22.6)	45	577	(29.8)
C57C	26	604	(27.6)	22	473	(30.9)
DBA/1	39	686	(33.3)	35	487	(35.9)
DBA/2	23	719	(35.4）	22	629	(42.1)
NZB	111	441	(12.1)	110	459	(13.3)
NZW	20	733	(42.8)	28	802	(34.0)
129/Rrj	36	666	(23.2)	35	699	(29.8)
LACA	40	617	(26.2)	36	536	(38.9)
LACA	33	664	(29.9)	41	660	(38.5)
WA	22	749	(40.1)	25	645	(29.9)
P	10	782	(51.9)	14	729	(42.9)

(四)应注意选择适合老化研究特殊需要的实验动物

1．老化研究的小型猪：早在18世纪初期，已认为猪在生理学研究，特别是在循环系统的研究上，是人的极好的模型动物。但由于猪体过大，给实验操作带来不便。1949年，美国明尼苏达大学Hormel研究所首次开发了小型猪。小型猪基本上达到了老化研究用实验动物的基准，成为理想的实验动物。小型猪的寿命大致和普通猪相同，其生理学性质与人相似。由于小型猪早期就可患自发性动脉硬化症，故已成为研究动脉硬化症的极为理想的实验动物。已有充分的事实证明，人的冠状动脉分布同猪极为相似，猪同样有脑血栓症和动脉硬化症病变。另外，猪还常用作包括心律不全研究在内的人体循环系统的模型。并可用于肾机能、胰脏、皮肤、繁殖、体温调节等的研究，它还具有与人类风湿性关节炎极为类似的自发性质的胃溃疡症。由此可知，小型猪和一般猪确是老化研究上极为理想的实验动物。

2．老化研究的裸小鼠：裸小鼠是先天性缺损胸腺的动物，故是一种完全缺乏T淋巴细胞（来自胸腺）而仅有B细胞的动物，即是一种细胞免疫不全动物。为了能看到老化进展状态，很多研究者都用裸小鼠进行观察。如果把此种裸小鼠饲养在无菌或SPF环境中，也可与正常小鼠同样发育而不患消耗性疾病，寿命也与正常小鼠相同。同此可知，消耗性疾病并不是由胸腺缺乏直接引起的，而是由感染引起的继发变化。因此，对以往着眼于胸腺和老化之间关系进行研究的消耗性疾病，有进一步探讨的必要。由于裸小鼠胸腺缺损，是研究胸腺和年龄之间关系的最合适动物。在实验时，必须饲养在严密微生物学管理的无菌、悉生或SPF的状态下。裸小鼠在老化研究方面可用于免疫和恶性肿瘤的研究。特别是作为自身免疫和老化关系研究的模型动物。

3．老化机制研究的豚鼠：关于老化的游离基学说一过氧化脂质学说，虽也常用大鼠和小鼠，但必须根据研究目的选择合适的实验动物。例如，研究肾上腺脂质的过氧化时，几乎不可能在大鼠的肾上腺中证实；而在豚鼠中，却能随着年龄的增长，检测其脂质过氧化物的增长状况。

二、老年病研究中实验动物的应用

（一）衰老机制的研究

北京医学院生化教研室发现老年大鼠脑细胞核内非组蛋白染色体蛋白质（NHCP）含量明显减少，从电泳图谱上发现NHCP丢失了分子量10万以上的两条蛋白带等，认为其NHCP发生了量与质的变化，影响了基因调控作用的正常进行，因而使中枢神经系统机能明显减退，北京医科大学基石医学系研究表明乙酰胆硷脂酶（ACHF）活性在大鼠中脑的红核和黑质明显地随年龄增长而降低，且开始于生命早期。

北京中医学院报告微量元素硒的抗过氧化脂质损伤作用，实验结果提示对动物补充适量硒，可以提高血液和组织谷胱甘肽过氧化物酶活性，催化过氧化脂质（LPO）分解。

（二）抗衰老药物研究

近年来国内外衰老药物的研究发展很快，但由于化学药的广泛使用及其毒性作用，世界研究方向已瞩目于植物药，祖国医学积累了很多抗老延年的宝贵经验，已引起国内外的极大重视，汕头大学医学院以明朝御方“长春不老丹”为基础制成“长春宝”，动物实验证明该药具有降血压、增加冠状动脉血流量、减慢心率、延长凝血时间等作用，对防治冠心病、高血压具有重要意义，黑龙江中医学院以清代宫廷常用补脾肾、益气补血方剂制成“滋生益等冲剂”，还以大黄、何首乌为主剂制成“回春仙冲剂”，认为该药具有调肠通便解毒、补血益气、活血化瘀、补肝肾等作用，可延长果蝇寿命，27.9%（♀）18.3%(♂)。广州中医学院报导中成药“养命室”具有抗小鼠注射环磷酰胺、地塞米松引起的免疫抑制作用，还报导了珍珠粉可以延长家蚕寿命，减少小鼠心、脑组织中脂褐质的含量。西宛医院以健脾养胃为主的“清宫寿桃粉”和“清宫八仙糕”可以延长鹌鹑的寿命。武没市医研究报导白蚁干粉可提高小鼠免疫功能，增强对移植性肿瘤细胞的攻击能力，还可提高动物的耐疲劳阈值。

（三）食疗的抗衰老研究

限食可以延缓衰老。宁波市医科所综合报导了目前国内外研究，均证实限食可以延长动物（鼠蚕、果蝇等）的寿命，可以低降动物心脑等组织中脂褐质的堆积，可以提高免疫应答水平，延缓肿瘤生长。北大生物系报导山楂、酸枣提取液可抑制脑单胺氧化酶的活性，可以延长果蝇寿命17.1～26.8%；降低小鼠心肌细胞脂褐质含量，减少过氧化脂质形成，促进SOD的活性。广西中医药研究所报导黑木耳提取物可显著抑制ADP诱导大鼠血小板聚积，延长小鼠常压缺氧下存活时间，可使动物脾脏明显增生，可抗环磷酰胺的脾萎缩作用，提示黑木耳对机体的体液免疫功能可能有促进作用。

第十二节　中医中药研究中实验动物的选择与应用

一、中医药研究中开展动物实验的意义

中国医药学自从有文字记载以来的几千年悠久历史中，总结了劳动人民长期和疾病作斗争的丰富经验。它对中华民族的繁衍昌盛有很大贡献，对世界医学的发展也有很大的影响。

科学研究最贵有创造性，有特点。在发展中、西医学的同时，用唯物辩证法指导中西医结合，对于促进我国医学科学发展、赶超世界先进水平具有重要意义。在唯物辩证法指导下用现代科学知识和方法整理研究世界各国各民族传统医学并与现代医学的精华相结合，创立新的世界医学，是实现世界医学史中从朴素辩证唯物论和形而上学影响下的旧医学飞跃为唯物辩证法指导下的新医学的正确道路。

医学科学研究中我们强调中西医结合方向决不是要闭关自守或夜郎自大。相反，我们对西医（更不用说其他现代自然科学）的一切长处都应该认真学习研究，要有分析地研究应用西医的一切新成就，引起可能引进、应该引起的新技术，注射西医和一切现代科学研究的新动向、新思路，以便洋为中用，启发思想，广开思路。另外，中国医药学这个宝库必须用现代科学知识和方法（包括各自然科学和现代西医中合乎科学的知识和方法）加以发掘、整理和提高。

从中医发展史看，中医学几千年来的研究途径几乎全是通过临床观察方法以认识疾病的发生、发展、变化规律及总结有效的防治措施。医学发展的历史证明：局限于临床观察方法是中医学发展缓慢的原因之一。动物实验是现代医学的常用方法和手段，中医药学利用动物实验方法，在一定范围内可以提示更为具体的中医理论本质，有利于中医学科学达到一个新的认识水平。

随着现代医学的迅猛发展，中医将动物实验手段从现代医学中移植过来，近几十年才逐渐发扬光大，将动物实验方法渗入到了中医生理、病理、方药、针灸、防治等研究领域，通过动物实验，提示了一些中医理论实质，为中医理论提供了一些实验科学依据，使动物实验方法在中医学研究中出现了新的苗头，表现了强大的生命力。总结近几十年中医动物实验研究概况，五六十年代多是通过动物实验研究针刺对疾病的防治作用；70年代多是通过动物实验进行中药药理研究；80年代则有通过动物实验，利用中医治疗手段对西药实验性病变进行防治。

中医药研究中开展动物实验的好处有如下几方面：

（一）可以替代人体，预测中药毒副作

古今中外有关中药毒副作用的记载并不少见，如：《淮南子·修务训》记载：“神农尝百草之滋味，水泉之甘苦，全民知所避就，当此之时，一日而遇七十毒”《备急千金要方》记载：“水银中毒发生口舌糜烂”近年来报导：误服大青龙汤致死；误服大承气汤致死。《日本医药品副作用文献抄录》报告：葛根汤、十味败毒散、八味地黄丸、柴胡加龙骨牡蛎汤、半夏泻心汤等36种方剂有副作用。还报导苍耳子中毒致死、乌头中毒致死等等。究竟有毒副作用的药物安全量是多大？中毒致死量是多少？服用后会出现哪些不良反应？哪些药物在什么情况下有毒副作用？以及发生毒副反应后如何救治？这些方面至今多还缺乏比较精确的认识。要解决这些问题，不可能也不允许在人体身上直接进行试验，因为医学的宗旨是为人类防病治病、增进健康的，所以最好的方法就是进行动物实验。

（二）可以严格控制实验条件，较可靠地证实治疗效果

人类疾病的转归除药物治疗外还受着多种因素的影响，如：气候环境、精神情绪、饮食劳逸等，这些因素在一定条件下会造成疾病好转或恶化。临床上还可见到由于患者产生强烈的治愈要求，对接受治疗产生良好的疗效愿望，心理上产生一种有效偏因，从而出现治疗有效的反应，即所谓的“假阳性”现象；反之，临床上也常见到患者在治疗中因饮食起居不慎或受到精神刺激等因素的影响，从而造成疾病恶化。这些情况都会造成医生在治疗疾病中产生错误的疗效判断。之所以有些个案报道或新方疗效报道的疗效结果在临床上重复使用时出现与原报道结果不符的现象；其原因之一就与其它因素影响有关。所以要比较可靠地评论药物在治疗效果就需要在严格控制各种影响因素的条件下进行，但是由于人类的高度复杂性，在多数情况下很难严格控制，而对于动物来说就比较容易严格控制。

（三）可以验证和发展中医理论，为中医理论提供实验科学依据

中医学产生于自然哲学时期，是在长期的医疗实践经验积累的基础上，以整体综合观察方法，在不干扰原有生理病理的情况下逐渐形成和发展起来的高度概括的医学理论。在其形成和发展过程中由于缺乏科学实验和其它科学手段，造成中医理论难以深入地提示更为具体的规律，出现一些笼统、抽象、模糊的概念，使丰富的实践经验与笼统、抽象、模糊的理论结合起来。动物实验可以使人的认识深入到直接观察难以达到的物质内部更深的层次，提示一些更为具体、更为确切的规律，尤其是当需从组织形成学角度来观察时，就更需要借助动物实验。通过动物实验不仅可以为验证中医理论提供科学的实验依据，而且可以进一步发展中医理论提供科学的实验依据。如：王氏为阐明“肺主通周水道”的理论，通过人工扩肺以增强免疫肺通气量观察对兔排出尿量的影响，发现当扩肺后2分钟左右每只动物尿量开始减少，伴随扩肺时间的延长，尿量减少越明显，停止扩肺后，尿量逐渐恢复到扩肺前水平。莫氏等在中医“肾开窍于耳”的理论基础上，用生物电作为内耳功能指标，证实了醛固酮对内耳功能有促进作用，由此提出把醛固酮作为联系中医肾与耳之间的物质基础的设想。辽宁中医学院等人通过对脾虚动物模型葡萄糖转运电位（PD）的观察分析，发现脾虚时PD明显地受到抑制，而四君子汤则有促进PD恢复的作用。日本的久保道德为说明桂枝汤具有发汗作用，他在小鼠血中注入炭，小鼠皮色变黑，病理切片有大量炭附着于皮肤肌肉下层组织的血管壁内，灌服桂枝汤为主方剂后，异物消除。

（四）可以缩短研究周期，加快中医发展

中医学的发展历史告诉我们：有此问题单凭临床经验积累需要花费很长时间才能得到解决，或者虽花费很长时间，问题仍得不到解决，而通过动物实验有些问题就可以得到迅速解决。如中药十八反中几对相反药，历来有人主张必须恪守，有人则认为不必绝对化，更有人认为合用显著的治疗效果，多少年来一直没有充分的依据来说明这一问题，有人通过动物实验仅在几个月内不仅证明了相反药配伍后毒性远比单味药高，而且证明了两种药物用量不同产生的毒性大小也不一样。

二、中医证型动物模型复制方法及动物选择

中医证型的动物模型大约有“阳虚”、“阴虚”、“脾虚”、“脉微欲绝”、“血虚”、“血瘀”、“肝郁”、“寒证”、“热证”、“温病”及“里实”等11种。其造型的思路和方法除个别者外，均是选择一些造成与临床证型相仿的致病因素，作用于动物机体使其产生类似临床某些证的模型，而致病因素不外乎物理、化学、生物以及某些内脏损伤或切除等。如①用生大黄、番泻叶、玄明粉造成脾虚运化失常模型；②用阿托品（胆碱能M型受体阻断剂）、利血平（耗竭儿茶酚胺类递质）造成植物神经功能失调拟脾虚、阳虚、阴虚模型；③根据中医饥饱无度、损伤脾胃的理论，用甘兰加猪脂使饮食失节造成脾虚生化乏源模型；④以大剂量醋酸氢化可的松使动物产生一系列耗竭现象，达到虚损状态比拟阳虚模型；⑤以适量的大肠杆菌静脉注射，复制急性和暴发性大肠杆菌败血症比拟温病模型；⑥依中医“正邪相争”理论为指导，用给动物注入强毒细菌以“助邪”及结扎血管阻断血运降低机体抗病力以“伤正”的办法，造成动物“里实”模型；另外，还开展了采用多种病因造型方法的尝试，其造型所用动物主要还是小动物（大、小白鼠），也有用金黄地鼠、家兔和猫的。给药（或作用）途径除胃饲外，是肌肉、皮下、腹腔及耳缘静脉注射。

中医证型动物模型造型方法。

1．“卫气营血”模型（熊启达等：四川医学杂志，（2）：65，1982）：选用家兔，体重2.1～2.75kg。用强毒力的大肠杆菌以0.75ml（每ml含大肠杆菌27亿个）/kg体重，注射至兔耳缘静脉造型。感染后动物表现蜷缩、懒动、少食、体温升高、心率增快、耳血管周围渗血、出血；舌象有明显病理改变；血培养有大肠杆菌生长，白细胞及血小板显著减少。可100%造型成功，适用于开展实验性温病研究。

2．“寒证、热证”模型（梁月华等：在医杂志，（11），1982．）：选用雌性大白鼠，体重170～210g。热证型：用温热药（附子、干姜、肉桂、党参、黄芪、白术）制成100%水煎剂灌胃，每次2ml，每日2次。寒证型：首先于腹腔内注射三联疫苗1ml，每日1次共2次；然后给予寒冷药（胆草、黄连、黄柏、银花、连翘、石膏）制成的100%水煎剂灌胃，每次2ml，日2次。给药后15天60-70%造型成功。热证型：心率加快，饮水量增多，尿内儿茶酚胺及17-羧皮质类固醇排出量增多。寒证型：心率减慢，尿内儿茶酚胺及17-羧皮质类固醇排出量减少。用此模型可测量痛阈和惊厥阈值及脑内介质；观察动情周期及血内孕酮含量。

3．“血瘀”模型：高粘滞血症模型（阮景绰等）：选用家兔，耳缘静脉注入10%葡聚糖生理盐水，每公斤体重注入5ml，可100%造型成功。给药后可见微循环血液变慢，红细胞聚集，全血及血浆粘度增加，血沉快，红细胞电泳变慢。此模型适用于“活血化瘀”药物作用原理的研究。

“血瘀”模型（毛腾敏：北医学报，（4）：305，1981。）：选用大白鼠，皮下注射0.1%肾上腺素0.2ml/次，日2次，加冰水刺激5分钟处置1日或2日，给药后次日，血粘度明显升高，血中纤维蛋白及红细胞压积亦升高。用此法连续处置2天，隔48小时处死，心肌出现散在性坏死灶。心肌病变能模拟克山病心肌坏死，此模型已用于大剂量维生素C治疗克山病机制的研究。

“血瘀”模型（金惠铭等：中华医学杂志，（1）：50，1982.）；选用家兔，耳缘静脉快速注射10%高分子右旋糖酐（HMWD）生理盐水溶液，剂量为1.5g/kg。注药后30分钟即可从微循环活体观察到血流明显减慢，血细胞严重聚集、微血管周围明显渗出和出血管微循环障碍表现。12～24小时后微循环障碍达高峰。此模型主要用于研究微循环障碍、中医血瘀及探讨活血化瘀药物作用原理。

第二军医大学亦用此法制造“”血瘀模型，选用未孕家兔，雌雄不构，体重2～2.5kg，10%HMWD静脉注射，每次15ml/kg，每周2次，历时10周。

4．“血虚”模型（贲长恩等：中医杂志（6）：69，1981.）：选用雄性大白鼠，体重180-250g。于实验第1、4、7天皮下注射2%乙酰基苯肼（Acety-Pheny　hydrazine,APH）生理盐水溶液，以每100g体重计，第1次1ml，第2、3次0.5mll给药后可形成实验性溶血性贫血。红细胞与血红蛋白减少，出现大量海氏（Heine）小体。可维持9～14天。此模型适用于血虚与气虚药物的研究。

5．“脾虚”模型（李传英等：淅江中医杂志（8）：355，1982）：选用雄性大白鼠。以大黄、玄明粉、玄明粉水煎剂和大黄、番泻叶的水浸泡液灌胃给药。给药后动物发生泄泻、清瘦、食量下降、精神萎磨不振，毛发欠光泽，基本符合临床脾虚病人症状。

另外还有报导选用昆明种雄性小鼠，体重18～20g；25日龄Wistar大鼠，体重70～100克；叙利亚金黄地鼠。用大黄水浸煎剂，小鼠0.5g/ml/日/只，金黄地鼠每日100g体重0.7～1.25g/ml，大鼠用15%大黄粉悬液3～5ml。胃饲法给药，每日1次，大鼠每日二次，给药后第8天90%以上造型成功。

6．“肝郁”模型（陈国林）：选用大、小白鼠。小白鼠腹腔注射艾叶注射液0.6ml（含生药0.3g），每日1次，分别于45天及60天处死。大白鼠腹腔注射艾叶注射液2ml(含生药2.0g)每日1次，半月后改为隔日1次，40天处死。艾叶中毒后动物易激怒，好斗，咬人，进食量少，体重增加慢。小白鼠：肝脏有灶性坏死，以60天组较45天组为重。大白鼠：肝细胞肿胀，胞浆疏松出现颗粒，门区有嗜酸细胞浸润，中央静脉充血。

7．“阳虚”模型：选雄性小白鼠，体重25～30g。以大剂量醋酸氢化可的松肌肉注射1mg/保，每日1次，约7次，约7次造型成功，适于研究补肾药的作用。也可选用20～28g小鼠，急性组织分别用利血平5、10、20、50、100、200μg/只；亚急性组，给500μg/kg（隔天下午）；均腹腔给药。亚急性组另加更生霉素74μg/kg，共7次，亦腹腔给药，均可100%造型成功，适于“形寒肢冷”证发病机理研究和探讨中药（理中汤）作用机理研究。还可给小鼠每日灌喂甲基氧嘧啶2.5mg/只或5-10mg/日，一周左右即可有95%造型成功，适用于观察受体与甲状腺素减少之间关系。

8．“阴虚”模型：选用雄性小鼠，体重20-30g，甲状腺素片3mg/只/月，利血平0.02mg/只/日共研成粉末，以生理盐水稀释，充分摇匀后灌胃给药。8～10天造型成功，适用于研究滋阴中药作用原理。

9．“阴证”与“阳证”模型（董筠一等：陕西中医学院学报，（3）：1，1981）：选用雄性小白鼠，体重20～30g。利血平10μg（溶于0.1ml盐水）/只/日肌注，4～5天后出现类似阴证症候；阿托品15～20μg/只/日肌注，，2天后出现类似阴证症候。适于观察机体各器官系统的机能改变，细胞水平的电生理变化以及中药或针刺对上述变化的改善情况。

10．“脉微欲绝”模型（左箴等：第二军医大学学报（1）：19，1982）：选用猫，经股静脉注入3%戊巴比妥钠溶液，按0.25～0.5ml/kg剂量造型。注药后心肌收缩力极度减弱，近于停跳状态，血压降至10mmHg左右，动物股动脉搏动微弱，几乎不能触及，可100%造型成功，适于观察强心升压药物，如附子制剂及其分离物的急性效应。

11．“气虚”模型（上海第二医学院：上海中医药杂志（5）：8，1964）：选用家兔，体重1.07～2.5kg，通过人工慢性贫血造型。每日由耳动脉、耳静脉或心脏放血10ml左右。动物可出现精神萎顿、嗜睡、四肢蜷缩，肌张力减低、体温较正常稍高。血细胞压积下降，总蛋白略有减低，舌质苍白、胖嫩、湿润。适用于“气虚”舌象研究。

12．“阴阳失调”模型（杨连卿等：中西药结合杂志（6）：353，1983）：选用雄性Wistar大鼠，体重235～297g。以外源性糖皮质激素地塞米松混悬液7.5μg/100g体重灌胃，每日下午时藻胃，共7次（7天实验）；另组同法灌胃28次，中途休息2天（30天实验）。经电镜观察，肾上腺皮囊状带细胞线粒体退行性变性变化明显，血浆皮质酮水平低下，示动物HPA（下丘脑一垂体-肾上腺皮质）轴功能受抑。

13．“里实”模型（孙爱真等）：选用狗，以中医“邪正相争”理论为指导。“助邪”，选择毒性极强的细菌，经多次复种，增强致病毒力后，注入阑尾肌层；“伤正”：结扎阑尾根部，并阻断血循环以大大削弱机体抗病能力。术后二天内拒食、神萎、倦伏不动；大体标本见阑尾粗大，浆膜面血管扩张、充血、有脓性、纤维素性渗出物，肠管增厚水肿、粘膜见散在坏死及溃疡形成，腔内积有浓性渗出物，镜检：阑尾腔内积有成片脓性渗出物，粘膜坏死、脱落，有肉芽组织增生，各层有不同程度充血、水肿等，WBC、MPT急剧升高。适于研究中医通里攻下治则作用原理以及大承气汤等复方的药理作用。

三、中医证型动物模型在中国药研究中的应用

国内早在1960年邝氏等就指出皮质素型动物（即醋酸氢化考的松模型、氨考模型或“阳虚”模型）一系列病态与阳虚临床特征基本符合。1963年邝氏等又观察发现，助阳药能减轻或纠正过量皮质素引起的动物耗竭现象，并对助阳药作用机理进行探讨，认为助阳药的作用并非单纯促进蛋白质合成或补充了钾或者替代肾上腺皮质激素，其确切作用机理是否是纠正了机体“阳虚”本质难以肯定尚待探讨。1964年上海第二医学院附属广慈医院舌研究小组，为开展气、阴虚舌象的动物实验研究，以人工慢性贫血及高位小肠侧瘘，造成“气虚”和“阴虚”模型。1977年上海中医学院正常人体学教研组，认为助阳及滋阴药能调节“阳虚”及“阴虚”现象，可反证造型的属性。1980年施氏等首先采用电镜技术观察某些助阳药对“阳虚”模型的肝细胞亚微结构的作用，发现助阳药能调节细胞核DNA复制及RNA、蛋白质合成，改善细胞能量代谢；同年，北京师范大学生物系消化生理科研组在国内首先报道用中药大黄水浸煎剂造成“脾虚”模型，并用四君子汤反证。1981年陕西中医学院生理教研室用改变植物神经系统机能状态的药物建立类似“阳证”（阿托品）及“阴症”（利血平）模型，并设想临床“阳症”和“阴证”的产生与交感、副交感神经系统机能的盛、衰有关，同年，贲氏等以皮下注射乙酰苯肼（APH）造成实验性溶血性贫血，拟“血虚”模型；同年，施氏等认为“阳虚”模型，早期以“阴虚”为主，滋阴药有一定作用，后期才以“阳虚”为主，助阳药对之有显著作用，说明中医阴阳贯穿整个疾病过程。1982年施氏等又发现某些助阳药对“阳虚”动物脾脏淋巴细胞有显著保护作用；严氏等对“脾虚”动物的体表冷光、温度及皮肤电阻、体重等多种体表物理信息的研究，发现体表冷光变化幅度最大，其次是体表温度、体重，而体表电阻较差，并认为这些指标有方便、快速无损等优点，是可取的；南京医学院中西结合研究组，开展了脾虚泄泻证的动物模型研究，认为番泻叶与大黄致泻理作用基本一致，但其用量为大黄的1/10，主张番泻叶可作为复制脾虚泄泻证动物模型的首选药物；张氏等认为助阳药能提高“阳虚”动物DNA合成率、降低死亡率；史氏等于家兔耳缘静脉注入10%高分子右旋糖酐造成“血瘀”动物模型，并观察川芎注射液治疗作用；梁氏等用三联疫苗及寒凉药造成寒证，以温热药造成热证模型，观察电刺激效应；夏氏等模拟几种常见的虚证病人，用不同方法同时建立四种（互相对立的两组）病理模型，即甲状腺功能亢进（甲亢组）及减退（甲减组）；糖皮质激素过多（氨考Ⅰ组）及肾上腺皮质抑制（氨考Ⅱ组）等四组。然后用滋阴药（生地、龟板）和助阳药（附子、肉桂）进行反证（即“诊断性治疗”）区分证型。结果，甲亢组和氢考Ⅰ组服用滋阴药有效（用助阳药反恶化），辩证为阴虚为主；甲减组及氨考Ⅱ组服用助阳药有改善（用滋阴药恶化），故属阳虚为主。上述情况与临床所见基本一致。另外，两组模型血浆中环核苷酸含量的变化与临床结果亦一致。本实验在方法学上进行了一些改进，采用了先注射β-肾上腺素激动剂（异丙基肾上腺素）或M-胆碱能激动剂（氨甲酰胆碱）引起血浆中cAMP和cGMP大幅度升高，然后取血测定cAMP、cGMP含量，且观察cAMP、cGMP系统对相应受体激动剂刺激的反应强度。从而，不仅相对提高了测定方法的灵敏度，且比单纯测定血浆中环核苷酸的含量，获得更多的信息。1983年徐氏等观察“阳虚”动物牙周变化及助阳药作用；耿氏等观察了助药对“阳虚”模型免疫功能影响；熊氏等以大肠杆菌注入兔耳缘静脉复制温病卫、气、营血模型；胡、关氏等观察大黄致虚模型的形态及免疫功能变化；黄氏等报道用100%的大黄、甘遂、大戟、芫花煎剂及100%的甘遂合剂（甘遂、芫花、大戟）喂饲小鼠未形成脾虚模型，而采用甘兰加猪脂喂饲小鼠则成功；施氏等观察到右归丸（温肾阳、补精血方剂）对“阳虚”动物肝细胞核亚微结构有保护作用，杨氏等用外源性糖皮质激素地塞米松灌胃造成下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴受抑模型。1984年于氏等建立脾虚荷瘤动物模型为临床健脾理气法治疗肿瘤获得一定的启示，马氏等观察到补骨脂注射剂能减轻因大剂量醋酸氢化考的松对肝细胞的损伤作用及使受氢考影响而下降的酶反应上升；李氏等以反映上皮细胞葡萄糖转运系统各种性能的葡萄糖转运电位（Transmural　Potential　Difference,PD）为指标，观察脾虚动物离体小肠不同环境下PD受抑，四君子汤有促进恢复的作用；另外，汪氏等还发现小鼠氨考模型的腹膜细胞总数显著减少，中药（附子、肉桂、仙灵脾等）对其有调节保护作用。

国外，1971年日本有地滋为了解膈肌、肝脏病变与胸胁苦满证的关系，在家兔身上进行了以下实验：①分别于左膈肌边缘及中央，肝右叶被膜及肝右叶（作45°角）等部位刺入两根粗0.5mm、长4mm的针并留针两周。②皮下注射四氯化碳0.3ml（隔日1次注射4次；继而隔5日1次共注射3次，同时每日胃内注入柴胡浸膏颗粒5g,计10天）。③连日皮下注射苯肼（Phenyl　hydrazin）。④肝左叶注入10%氢氧化钠及肝右注入10%盐酸等。根据2周后检查所见认为，胸胁苦满体征（捏诊皮肤增厚、压痛；观察压痛的方法是：将动物的四肢和颈部固定，捏诊时躯干部跳起）与季肋部浮肿带的病变相同，为同一体征。当肝损伤严重及膈肌边缘部发生病变时均出现胸胁苦满证，而单味柴胡剂有防止出现该证的效应。另外，还观察到膈肌中央部位病变（出现于胸骨柄一带），表现为梅核气，而贫血引起的膈肌、肝脏等部位血流量减少时，不出现胸胁苦满。1984年日本久保道德为研究伤寒论方剂的药理作用而制作中医“证”的动物模型；以病毒、细菌及致敏物质（异性蛋白和多糖抗原）造成太阳病模型，并用桂枝汤反症；以自身免疫性疾病--大鼠佐剂性关节炎当作胸胁苦满证的模型；抗原抗体反应可导致轿小板聚集、血栓形成而诱发瘀血症模型；大鼠佐剂性关节炎2个月后注入酪蛋白，再经过2个月后出现阴证，八味丸对其有预防作用。

四、中医药研究中开展动物实验应注射的问题

（一）中医证型动物模型的制作方法和评价问题

中医诊治疾病的核心是辩证施治，所以制作中医证候动物模型是研究中医的重要手段。目前，称之为中医“证”的动物模型。一般有两类：一是根据临床某些证候表现，采用相应的手段在动物身上复现，再用临床常用的方剂反证，有效者亦称之为某证型的模型，如“脾虚”型、“阳虚”型等；另是无明确设想，即用某种方法造成病的模型，把西医“病”的模型当成中医某种证的模型，如，将溶血性贫血称之为“血虚”模型或以高粘滞血症作为“血瘀”模型等，前者比起后者较有思路、设想，具有一定的中医特色，当然严格说来也不能排除急性药物中毒所造成的病理状态。

近二十多年来制作成中医证候的动物模型约有十几种，制作方法包括病因模型和症状模拟。病因模拟如饥饿引起脾虚、风寒湿引起痹证等。这种方法所复制的中医证候动物模型，从形式上看很有中医代表性，但是中医对于病因造成证候发生这一过程的认识还很笼统，其中尚有一部分还没有从个性中找出共性，甚至从偶然性中找出必然性，再者所认识到的同一致病因素又会造成多种证候发生，而不同的致病因素也会造成同一证候发生；而且还有相当一部分致病因素又难以作用于动物等；症状模拟如用大剂量醋酸氢化可的松复制阳虚模型，出现体重减轻、拱背少动、反应迟钝、体毛不荣等。这方法存在的问题在于中医证候不仅是几个症状相加，而是对病因、病性、邪正盛衰等情况的概括。

复制祖国医学“证”的动物模型难度较大，因为中医的证是疾病的病因、病位及病邪性质的概括，且临床多以病人主观感觉反映出来，确切的客观指标尚在探索之中，即使客观表现如舌象、脉诊及神志等也不易在动物身上模拟出来。所以，多数学者认为目前只有尽可能从“证”的临床辩证标准来评价中医“证”的动物模型。

（二）判断中医证候模型成功与否问题

至今判断中医证候动物模型的方法有两种：一种是根据病因、症状直接判断；一种是根据常用方剂反证。从直接判断来看，由于低等动物皮毛与人有差别、语言不通脉诊又不适于动物等，这就造成有相当一部分病情资料，按中医传统的望、闻、问、切诊察方法在动物身上难以收集。所以对于复制的中医证候模型成功与否，因病情资料不全而难以给予比较确切的判断。如近年来复制的肝郁模型，动物表现是易激怒、好斗咬人、进食量少、体重增加慢。这一模型按中医传统的辩证方法来衡量，仅从症状来看也难以说就是中医的肝郁证。因为在症状方面还缺少胸胁满闷、善太息、脉弦等辩肝郁证的主要依据；从反正法来看，用临床常用的方剂作用于从病因、症状尚难以直接判断的模型动物，有效者称之为该证型，如用补脾药有效的可能是脾虚证。由于中医辩证施治具有高度的灵活性，而且对于相当一部分证候的治疗用什么方药至今还不完全统一，所以这一方法必须建立在一定的基础之上。

（三）利用西药动物模型问题

中医研究中不能无明确设想，如未能以中医理论为依据，单纯把西医疾病模型当成中医证的模型，用此研究中药药理尚可，但要作为中医证的模型则不相宜。如中药对动物实验性关节作用的研究、大柴胡汤对动物实验性急腹症作用的研究、Ⅲ号排石汤对实验性肾结石作用的研究、四逆散对动物实验性休克作用的研究等，都是用西医现成的动物模型。这种方法对于进一步研究中药疗效和促进中西结合可能有一定的参考意义，但是对于发扬中医特色来说则无多大参考价值。因为中医诊治疾病有其独特的方法，理法方药有其一套理论体系，中西医之间无论理论上还是在临床上都有着相当大的差别。临床上经常可以看到同一种西药疾病，中医可能诊断为多种证候，用不同的方法来治疗；而对不同的西医疾病，中医也可能诊治方法完全相同。所以要研究中医、发展中医，在进行动物实验时，不能完全照搬西医动物模型，否则就弃掉了中医几千年来总结的、至今仍极为宝贵的辩证施治规律。

（四）中医动物实验设计问题

中医研究中动物实验设计应考虑到人与动物的差异问题。人与动物的生命现象，其基本的生命过程，有一定的共性。这是医学实验中可以应用动物实验的基础，但另一方面，不同种属的动物，在解剖、生理特征、病理特点和对各种因素的反应上，又各有其个性。例如不同种属动物对同一致病因素的易感性不同，甚至对一种动物是致命的物质，对另一种动物可能完全无害。我国古代就已认识到：“人食矾石而死，蚕食之而不饥；鱼食巴菽而死，鼠食之而肥，类不可必推”正因如此动物的疾病模型和人类的对应病证，虽有相似之处，但不一定完全相同。另一方面由于在动物实验中往往仅改变一个条件，而使其他因素保持不变，而人体的许多生理过程是同时受多种因素影响的，显然在比较简单的条件下，得出的结论，可能就不一定完全适用于较复杂的人体情况。

根据中医整体观的特点，在中医模型客观化研究中，以体表物理量（如体表冷光、体表温度和电阻以及体重等）为指标，快速、无损的探查方法是可取的，值得进一步探索。

采用多种病因、以不同的方法同时建立几种互相对立的模型以及指标测定方法学的改进等，不仅相对提高了测定方法的灵敏度，且获得了较大的可信性，思路和方法学上的这种改进，在中医模型研制中也是一个可喜的苗头。

中医“证”的动物模型主要用于各种证型产生、发展及转归的规律性探讨，并寻找其预防和治疗的理论根据。而中药药理的研究，一般说来，则不必拘泥于此，其现代医学多种病理模型（或制备的标本）均可采用。

（五）关于“脾虚”和“阳虚”动物模型评价问题

关于“脾虚”动物模型：①迄今对脾虚泄泻动物的评价，尚无肯定的意见。从大黄致虚模型来看，致虚物大黄是中医常用的苦寒药，我国医家通过临床大量医疗实践认识到，过量服用苦寒泻下药伤脾胃、耗正气，产生脾胃虚寒；又依中医“虚者补之”的道理，用适量四君子汤等理气健脾方药可使脾虚模型复健。从临床脾虚辩证标准及药物反证作用来看，大黄致虚的动物病理模型符合脾虚证。但也有作者用苦寒泻下法复制脾虚模型未成功；还有人认为，在短期内用过量大黄所致“脾虚”大鼠模型在唾液腺分泌功能方面与临床脾虚病人所见，不完全相符。②依据饮食不节，饥饱无度损伤脾胃的道理，采用甘兰加猪脂喂饲养动物制成腺虚模型，其设计思路较合理，且操作简单，制作容易。③采用饮食蛋白缺乏这样一种单纯因素短期内使动物呈现恶性营养不良状态，与临床脾虚证不尽相同，认为用此种状态代表中医临床的脾虚证似欠相宜。

关于“阳虚”动物模型：自60年代初，国内即有文献报道，应用大剂量外源性糖皮质激素可导致实验动物耗损，出现一系列虚损症状，类似中医的“阳虚”，此种异常状态可用助阳药经纠正，故称之为“阳虚”模型。目前国内普遍采用这一方法复制“阳虚”模型，并开展了一系列的、多指标的助阳药药理研究工作。关于此种造型的评价，亦持不同见解，国内有人比较不同种类糖皮质激素（醋酸可的松、醋酸氢化可的松--为混悬剂，局部注射后吸收慢，作用时间长交易造成蓄积；氢化可的松琥珀酸钠、地塞米松--水溶性制剂，注射后吸收快，毒性作用小）对造型的影响，结果认为“氢考”所致的“阳虚”表现，可能是混悬剂长期应用所导致药物的在体内积蓄中毒反应的结果。本造型方法值得商榷，而慢性“阳虚”模型有待研究探讨。